Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Interactions Lympho-épithéliales pour l'année 1999

INSTITUT PASTEUR, Laboratoire Interactions Lympho-épithéliales


Responsable : PRINGAULT Eric (epringau@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Dans le tractus gastro-intestinal, l'échantillonnage des antigènes et le déclenchement d'une réponse immunitaire locale a lieu au niveau des plaques de Peyer. Ces plaques de Peyer sont formées d'un épithélium intestinal particulier (FAE), recouvrant un ou plusieurs follicules lymphoides, constitués de lymphocytes B et T CD4+, et de macrophages et de cellules dendritiques présentant les antigènes. Le FAE est composé de cellules épithéliales entérocytaires, et de cellules M. Les cellules M diffèrent essentiellement des entérocytes adjacents par l'absence d'une bordure en brosse organisée et par la présence d'une invagination de la membrane plasmique contenant des lymphocytes. Les cellules M des plaques de Peyer ont une fonction importante dans l'acquisition de l'immunité mucosale, par leur capacité à transporter les antigènes et les micro-organismes à travers la barrière épithéliale et à les adresser au niveau du follicule lymphoide responsable de la mise en place d'une réponse immunitaire locale de type IgA. Ces cellules jouent également un rôle important dans les étapes précoces de pathologies infectieuses, puisque de nombreux microorganismes pathogènes utilisent cette voie d'entrée pour franchir les barrières muqueuses.En raison de la rareté des cellules M dans les épithélium muqueux, il n'est pas possible d'en obtenir des préparations purifiées et leur étude biochimique demeure à ce jour impossible. La biologie cellulaire et moléculaire des cellules M n'est donc pas connue. Nous avons développé un système de co-culture de lymphocytes de plaques de Peyer et de cellules intestinales humaines permettant de transformer les entérocytes développant une bordure en brosse homogène en cellules de type cellule M dont les propriétés de surface apicale sont modifiées (absence de bordure en brosse, redistribution du cytosquelette, disparition d'hydrolases spécifiques), et qui ont acquis une fonction de translocation orientée de particules inertes (billes de latex fluorescentes). Ces co-cultures, au contraire d'une monocouche de cellules intestinales cultivées seules, expriment des sites d'adhésion apicaux pour Yersinia enterocolitica et transporte cette bactérie, qui est relarguée du côté basolatéral. Des résultats identiques ont été obtenus avec Vibrio cholerae O:1. Le système de co-culture présente donc des caractéristiques structurales et fonctionnelles de l'épithélium associé aux follicules des plaques de Peyer et des cellules M. La nature des interactions lympho-épitheliales ainsi que l'adhésion et la translocation de microorganismes sont étudiés dans ce système. Les questions posées sont les suivantes : quelle est la sous-population de lymphocytes responsable de l'induction de cellules M ? Le contact cellulaire est-il requis ? Quels sont les molécules (cytokines, molécules d'adhésion) impliquées? Quelle (s) voie (s)s de signalisation intracelluliare déclenche le remaniement d'actine et la transcytose ? Quelles molécules bactériennes et eucaryotes sont impliquées dans l'interaction pathogène-cellule M ?. Ce modèle de co-culture permet d'étudier ces questions par des méthodes ultrastructurales et immunocytologiques, dans un système dont les paramètres sont controlés. Il permet de développer et d'utiliser des méthodes quantitatives, cinétiques et biochimiques.

Abstract

In the digestive tract, antigens and micro-organisms should cross the mucosa to induce immune specific and non specific immune responses or acquisition of tolerance. In the esophagus, dendritic cells could make direct contact with antigens. In contrast, in the intestine, the whole epithelium is tigh : the major sites of antigen and microorganism sampling occur at the level of Peyer patches. These lymphoid follicules are separated from the lumen by a specialized epithelium that contains M cells, taking up foreign material and microrganisms and delivering them by transepithelial transport from the external environment to the lymphoid follicules. Studies on molecular mechanisms of adhesion to and translocation through digestive mucosa are very difficult to perform in animal models. We have thus developed in vitro models reproducing the characteristics of digestive mucosa, i.e. a model of pluristratified epithelial cells from the esophagus, and crypt or differentiated epithelial cells cocultured with immune cells. So far, co-cultures of epithelial esophagus or intestinal cells with dendritic cells and/or Peyer’s patch lymphocytes have provided convient models for the study of antigen uptake by APC in systems containing or not M cells (see Kernéis et al., 1997, Science, 277, 949-952). Adhesion and/or transport of inert particles and bacteria are analysed in these system by ultrastructural, immunocytochemical, and biochemical methods in order to identify epithelial surface molecules involved in pathogen-epthelial interactions and translocation. These cultured models, using human cells, represents a controled system in which quantitative and kinetical methods can be developed, and provides access to the early steps of infection. So far, this model has permitted to quantify the adhesion efficiency of several bacterial species and to measure their rates of transanlocation. Profiles of M cell surface proteins involved in these procceses can be compared and identified. We have provided the first evidence that bacteria, virus and immunostimulants are preferencially taken up by M cells and directly delivered to underlying APC and lymphoid cells. Thus, these coculture models can be used for the development of bacterial or biochemical vectors to target the mucosal immune system.

Texte du rapport

THEMATIQUE GENERALE : MODELISATION IN VITRO ET IN VIVO DU FRANCHISSEMENT DE LA MUQUEUSE INTESTINALE PAR LES ANTIGENES, BACTERIES ET VIRUS, VIA LES CELLULES M DES PLAQUES DE PEYER. BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE DES CELLULES M.

  1. INTRODUCTION : échantillonnage des antigènes et des micro-organismes au niveau de la barrière épithéliale digestive. Dans le tractus intestinal, l’échantillonnage des antigènes, prélude au déclenchement d'une réponse immunitaire locale ou systémique, a lieu au niveau de régions spécialisées appelées plaques de Peyer. Elles sont constituées de follicules lymphoïdes recouverts par un épithélium particulier (EAF pour épitélium associé aux follicules lymphoïdes), fonctionnellement différent de l'épithélium intestinal normal, au sens où cet épithélium a perdu la plupart des fonctions digestives et des fonctions de défense antibactérienne, facilitant ainsi l'accès des micro-organismes. Cet épithélium contient un type de cellules particulier, les cellules M, qui ont la capacité de transporter toutes sortes de particules, bactéries et virus présents dans la lumière intestinale et de les délivrer intacts au niveau du follicule lymphoïde sous-jacent (Kraehenbuhl et Neutra, 1992 ; Neutra et al., 1996). Ces particules et micro-organismes sont alors capturés et traités par des cellules spécialisées de la lignée sanguine, les cellules dendritiques et les macrophages, qui vont présenter des motifs immunogéniques correspondants au système immunitaire, étape initiale du déclenchement d'une réponse locale ou de l'acquisition d'une tolérance. Les micro-organismes pathogènes doivent, pour exercer leur effets physiopathologiques, interagir et /ou franchir les barrières muqueuses. Beaucoup de pathogènes infectant leur hôte via le tractus intestinal vont utiliser de façon opportuniste les cellules M pour franchir la barrière muqueuse intestinale. C'est le cas notamment de Yersinia enterocolitica, de Salmonella typhi, de Shigella flexneri.. En raison de la rareté des cellules M dans l'épithélium intestinal, les études biochimiques sont à ce jour impossibles. La biologie cellulaire et moléculaire des cellules M est donc inconnue. Nous avons développé un système de co-culture "in vitro", mettant en contact des cellules intestinales humaines immortalisées et des lymphocytes. Les entérocytes se transforment en cellules ayant acquis les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des cellules M (Kernéis et al, 1997). Ceci permet donc de reconstituer les étapes précoces de l'infection (franchissement de la barrière muqueuse) dans un système simplifié où les paramètres sont contrôlés. Il se prête aux méthodes biochimiques qui permettront d'identifier les molécules impliquées dans d’interaction cellule M/pathogènes.
  2. RESUME DES RESULTATS ANTERIEURS. Etablissement d'un modèle de cellules de cryptes de l'intestin grêle de souris. La lignée cellulaire ICcl-2 (Bens et al., 1996), a été établie et caractérisée en collaboration avec A. Vandewalle, INSERM, Paris. Cette lignée a été obtenue par trans-immortalisation ciblée, à partir de cryptes micro-disséquée de souris transgéniques pour le gène hybride promoteur de la L-pyruvate kinase/antigène T du virus SV 40. Elles présentent en culture, sur des supports recouverts de collagène, les caractères spécifiques des cellules épithéliales de crypte intestinale (bordure en brosse rudimentaire, expression intracellulaire de la saccharase isomaltase, expression des récepteurs aux immunoglobulines polymériques et de glycoconjugués trouvés dans les granules de sécrétion des cellules de Paneth).

Origine épithéliale des cellules M
Les cellules M se distinguant des entérocytes notamment par l'absence de bordure en brosse, nous avons étudié le réseau de micro-filaments présent dans ces cellules qui doit donc être différent par son organisation et/ou sa composition. Notamment, une protéine associée à l'actine filamenteuse, la villine, joue un rôle clé dans l'assemblage et le désassemblage de la bordure en brosse (Friederich et al. 1989, 1990, 1992). Cette protéine tissu spécifique est un marqueur de l'origine endodermique des cellules épithéliales (Maunoury et al. 1988,1992; Robine et al. 1985, 1993 ; Pringault et al., 1986, 1991). Une étude immunocytochimique nous a permis de montrer que la villine est exprimée dans la totalité des cellules de l'épithélium des plaques de Peyer, y compris au niveau des cryptes. Au niveau du EAF des plaques de Peyer, la villine présente une distribution cytoplasmique inhabituelle dans une sous-population des cellules du EAF. Cette sous population a été identifiée comme étant des cellules M, par une étude parallèle en immunoperoxydase observée en MET (Kerneis, S., Bogdanova , A.N., Kraehenbuhl, J.P. and Pringault, E. (1995) « Cytosolic redistribution of villin in M cells of the intestinal Peyer's patches correlates with the absence of brush-border. » Gastroenterology, 110 : 515-525). Cette localisation cytoplasmique de la villine dans les cellules M traduit la réorganisation du réseau de micro-filaments et permet de discriminer, en microscopie optique, les cellules M des entérocytes absorptifs (dans lesquels cette protéine est concentrée au niveau de la bordure en brosse) . L'expression de villine maintenue dans les cellules M démontre donc leur origine endodermique et confirme que les cellules M dérivent des cryptes entourant les plaques de Peyer.

Reconstitution in vitro des propriétés d'un épithelium de type EAF : co-cultures d'entérocytes et de cellules du follicule lymphoïde. Les résultats précédents montrent que les cellules souches intestinales sont capables de se différencier en cellules M sous l'influence d'une population lymphoïde exogène. Il paraît donc concevable d'envisager une induction de cellules M en culture à partir de lignées de cellules cryptiques ou de cellules entérocytaires déjà établies. Un système de co-culture de lignées de cellules épithéliales intestinales entérocytaires ou cryptiques, cultivées en présence de lymphocytes de plaques de Peyer de souris (dont la capacité d'induction a été démontrée précédemment in vivo) a donc été développé. Les cellules intestinales sont cultivées sur des filtres de porosité de 3 mm dans un système inversé, sur la face inférieure du filtre. Les cellules folliculaires des plaques de Peyer de souris BALB/c donneuses sont rajoutées du côté basolatéral. Les résultats obtenus avec la lignée humaine Caco-2 montrent que les lymphocytes B et T sont capables de franchir la membrane poreuse, de dégrader la matrice cellulaire synthétisée par les cellules épithéliales et de se loger dans la monocouche épithéliale (Kernéis et al., 1997). La lignée Caco-2 cocultivée en présence de cellules folliculaires (co-cultures Caco-2/PPLy) maintient une polarité de type épithélial. La présence de cellules folliculaires dans la monocouche épithéliale induit fréquemment une modification de la structure du pôle apical des cellules Caco-2 (bordure en brosse absente ou désorganisée, apparition de "ruffles" à l'apex des cellules), associée à une diminution de l'expression apicale de la saccharase-isomaltase, et à une réorganisation du réseau apical d'actine et des protéines associées. D'un point de vue fonctionnel, les cellules Caco-2 co-cultivées avec les cellules folliculaires acquièrent spécifiquement la capacité de transporter des particules inertes (billes de latex fluorescentes) depuis le milieu apical vers le milieu basolateral. La cinétique du transport est rapide, après un temps de latence de 10 min. Ce système de co-culture nous permet donc de transformer une monocouche d'entérocytes développant une bordure en brosse homogène en un épithélium présentant des propriétés communes avec le EAF et les cellules M (propriétés de surface apicale modifiées, apparition de "ruffles", redistribution du cytosquelette, disparition d'hydrolases spécifiques, nouvelle fonction de transport orienté de particules inertes). Le modèle en culture de franchissement de la barrière épithéliale intestinale permet d'utiliser des méthodes ultrastructurales et immunocytologiques, dans un système dont les paramètres sont contrôlés. Il permet également de développer et d'utiliser des méthodes quantitatives et cinétiques, donnant accès aux étapes précoces de l'infection simulée. La nature moléculaire de l'interaction micro-organismes/surface intestinale peut y être étudiée par des méthodes biochimiques. Les résultats obtenus devraient donc faciliter l'identification définitive de la voie de passage des micro-organismes au travers de l'épithélium intestinal. Cette partie du projet devrait déboucher à plus long terme sur l'identification des voies de signalisation intracellulaires responsables de la translocation.

C. COMPTE-RENDU DES TRAVAUX DE RECHERCHE. Le rapport présenté ici rapporte l’ensemble des activités purement scientifiques du laboratoire, des collaborations et des invitations aux Congrès Internationaux. La thématique générale développée le laboratoire depuis sa création s’est développée selon deux axes principaux : 1/ Physiopathologie des cellules M:
Identification des inducteurs, des voies de signalisation, et des protéines de structure impliquées dans la conversion phénotypique (perte des fonctions nutritionnelles, réorganisation du réseau d'actine, activité de transport orienté). Etude des mécanismes et des facteurs cellulaires et bactériens impliqués dans la translocation des micro-organismes. 2 Régulations transcriptionnelles dans l’épithélium intestinal associé aux follicules lymphoïdes (EAF) des plaques de Peyer Lignées murines de cellules de cryptes intestinales pour l'étude des modifications transcriptionnelles associées à la formation du EAF. Transfection de ces cellules par des constructions contenant des promoteurs tissu-spécifiques, inversement régulés sur l'axe crypte-villosité et sur l'axe crypte-EAF, couplés à des gènes rapporteurs. Identification des différences existant dans les combinatoires de facteurs de transcription sur chacun des axes.

1/ Physiopathologie des cellules M (Sophie Kernéis, Nadim Hamzaoui Elise caliot, Eric Pringault).

Différentes familles de micro-organismes, surtout des pathogènes (qui sont d’avantage étudiés), sont identifiées selon leur mode d’interaction avec les cellules M. Certaines vont adhérer aux cellules M sans être internalisées et transportées par ces cellules (Escherichia coli RDEC1), d’autres vont détruire ces cellules provoquant une ouverture de la monocouche (Salmonella), d’autres vont utiliser les cellules M comme voie de passage et être adressés au follicule lymphoide où elles seront prises en charge par les macrophages et détruites (Vibrio cholerae) ou bien se multiplieront dans la région sous muqueuse et vont se disséminer (Yersinia species), enfin d’autres comme Shigella flexneri vont être internalisées par les cellules M et se disséminer progressivement dans l’épithélium par un mécanisme d’invasion latérale vers les entérocytes adjacents (Siebers et Finlay, 1996). Nous avons étudiés cinq types de bactéries pathogènes dont l’infection intervient au niveau de l’intestin, parmi les plus étudiées, afin de disposer du maximum d’outils d’analyse disponibles : Vibrio cholerae, EPEC, Shigella flexneri, Yersinia enterocolitica et Listeria monocytogenes. Nous avons étudié parallèlement l’interaction de ces bactéries avec les cellules Caco-2 et les co-cultures (Caco-2+ Lymphocytes). L’infection des cellules est effectuée dans le système inversé, les bactéries sont placées dans la chambre inférieure à raison de 108 bactéries par filtre. Sur ce système nous pouvons étudier parallèlement trois facteurs, l’adhésion, l’invasion et la translocation des micro-organismes. Les quantifications ont été complétées par une étude immunocytochimique analysée en microscopie confocale et microscopie électronique à transmission., nous permettant de caractériser l’interaction bactéries-cellules M et de rechercher la voie de passage de ces bactéries au travers des cellules de type M. Etude comparative de l’interactions de différentes espèces de bactéries pathogènes avec les cellules de type M en culture.. Pour chacune de ces bactéries nous étudions leur interaction avec les cellules Caco-2 et les co-cultures Caco-2/PPLy. Nous quantifions la cinétique d'invasion et de translocation de ces bactéries par la détermination du nombre de colonies formées ("colony forming units", CFU); après lavage et lyse du tapis cellulaire (adhésion + invasion), après incubation en présence de gentamycine puis lavage et lyse du tapis (invasion), et après prélèvement du milieu apical (translocation). Chaque point est réalisé en triplicata, sur trois co-cultures indépendantes. Les résultats sont complétés par une étude immunocytochimique, analysée au microscope confocal, et une étude en microscopie électronique (transmission et balayage). a) Vibrio cholerae
Vibrio cholerae. adhère indifféremment sur les entérocytes et les cellules M. En revanche, la bactérie est transportée uniquement par les cellules M. La pathogénie de cette bactérie est uniquement liée à la présence de la toxine cytotonique qui provoque des diarrhées importantes. L'échantillonnage de cette bactérie vers le follicule lymphoïde sous-jacent permet la mise en place d'une réponse immunitaire vis à vis de cette toxine. Le traitement est possible par antibiothérapie et réhydratation. La plupart des pays touchés ne possède pas l’infrastructure médicale suffisante pour lutter contre cette infection. La mise en place d’une stratégie vaccinale est donc d’une grande importance. Pour ce faire il est nécessaire de comprendre les stratégies de transport de cette bactérie par les cellules M et son adressage au follicule lymphoïde sous-jacent. La mise en place du système de co-culture devrait nous permettre d’identifier les partenaires cellulaires et bactériens impliqués dans ce processus. Nous avons donc tout d’abord mené une étude pour rechercher si le système de co-culture reproduisait in vitro la translocation de Vibrio cholerae observée in vivo. Nous avons utilisé la souche de sérogroupe O1, sérotype Ogawa, pour laquelle nous avons pu bénéficier d’anticorps polyclonaux anti-LPS fournis par J.M.Fournier, Institut Pasteur, Paris. L’adhésion de la souche ne montre pas de différence significative entre Caco-2 et le système de co-culture. L’invasion du système de co-culture par contre montre une augmentation d’un facteur 8, enfin, la translocation est augmentée d’un facteur 100 en présence des lymphocytes. Ce processus de translocation est dépendant de la température (il est en effet inhibé à 4°C) et du réseau de microtubules (inhibé par 10 mM de colchicine). Ces résultats sont confirmés par analyse en microscopie confocale. Une étude supplémentaire menée en microscopie électronique à transmission (en collaboration avec leDr. P. Gounon, Institut Pasteur) nous a permis d’observer la présence de bactéries dans des vacuoles cytoplasmiques dans le système de co-culture. Ajouté à l’inhibition par la colchicine, ceci démontre que le transport se fait par voie intracellulaire. b) Shigella flexneri
Shigella flexneri est une bactérie Gram- responsable de la dysentérie bacillaire. Cette bactérie utilise la cellule M pour franchir la barrière épithéliale et infecter les entérocytes par leurs pôles basolatéraux. La bactérie va, suite à son passage par les cellules M, infecter les macrophages sous-jacents. La mort des macrophages induite par la présence de la bactérie va provoquer la libération d’IL1 conduisant à une infiltration de leucocytes polymorphonucléaires, ouvrant les jonctions cellulaires responsables de brêches dans le tapis cellulaire. Les Shigella vont alors pouvoir franchir la barrière épithéliale pouvant de ce fait infecter les cellules épithéliales via leur membrane basolatérale. L’essentiel du travail réalisé sur l’interaction de Shigella avec les cellules M a été fait in vivo, il nous a paru intéressant d’étudier le processus d’interaction de cette bactérie avec le système de co-culture. Nous avons mis en place une collaboration avec l’équipe du Pr. Philippe Sansonetti, Institut Pasteur, Paris. Le pôle apical des cellules Caco-2 en présence ou non de lymphocytes est infecté par la souche sauvage M90T de Shigella flexneri, pendant 1 heure. Au terme de cette incubation la translocation de la bactérie est quantifiée, la résistance trans-épithéliale mesurée avant et après infection permet d’évaluer le maintien de l’étanchéité du tapis et donc de pouvoir interpréter les résultats en terme de bactéries transportées spécifiquement. Après une heure d’infection la translocation de M90T est augmentée d’un facteur 100 dans le système de co-culture par rapport aux cellules Caco-2 et ceci sans modification significative de la résistance trans-épithéliale (RTE). Le transport de cette souche est inhibée à +4°C (5.2 ± 2.4 x 104 CFU/cm2 après la première heure d’infection à +4°C, (n=10); 1.8 ± 106 CFU/cm2 après la deuxième heure d’infection à 37°C des mêmes filtres). De façon à démontrer que le transport se fait par transcytose et non par voie paracellulaire, nous avons utilisé la colchicine 10mM qui dépolymérise de façon irréversible le réseau de microtubules. Celui-ci est indispensable au routage intra-cellulaire des vésicules. Le transport à travers les co-cultures est alors inhibé d’un facteur 10 (1.8 ± 0.6 x 104 CFU/cm2 en présence de colchicine, 1.2 ± 0.4 x 105 CFU/cm2 en absence de colchicine). Les souches sauvages de Shigella flexneri ont un plasmide de virulence de 220kb nécessaire pour l’invasion des cellules épithéliales. De façon à savoir si ce plasmide de virulence est nécessaire à l’entrée des Shigella dans les cellules M, nous avons réalisé une étude comparative et quantitative de la translocation bactérienne dans le système de co-culture de la souche BS176 dépourvue de ce plasmide de virulence par rapport à la souche sauvage M90T. Le niveau de translocation des deux souches est analogue, suggérant que le plasmide de virulence de Shigella flexneri ne soit pas indispensable dans l’entrée de cette bactérie dans les cellules M. c) Yersinia enterocolitica
Yersinia enterocolitica est une bactérie invasive seulement par le pôle basolatéral des cellules entérocytaires, nécessitant un franchissement préalable de l'épithélium intestinal par les cellules M. Yersinia enterocolitica est responsable d'une entérocolite aiguëe associant fièvre et diarrhées. Des complications articulaires peuvent survenir dans les deux cas. Cette bactérie n'adhère pas aux entérocytes différenciés de l'épithélium intestinal villositaire, mais présente une adhésion significative sur les cellules de l'épithélium des plaques de Peyer, que ce soient les entérocytes ou les cellules M. Elle franchit l'épithélium intestinal par les cellules M, lui permettant d'accéder au pôle basal des entérocytes, qu'elles envahissent. L'invasine, protéine codée par un gène chromosomique, est impliquée dans le processus d'invasion de Yersinia. Cette protéine se lie aux intégrines b1 localisées au pôle basolatéral des cellules entérocytaires. L'étude de l'adhésion et de l'invasion de cette bactérie (fournie par I. Autenrieth, Munich, Allemagne) sur les cellules Caco-2 et les co-cultures est actuellement en cours. Elle est effectuée par marquage immunocytochimique des bactéries par un anticorps anti-LPS, et du pôle apical des cellules Caco-2 par la lectine UEA1 couplée à la rhodamine. Les premières expériences ont montré l'apparition de nombreux sites d'adhésion apicaux sur les co-cultures, sous forme d'amas bactériens. Cette adhésion apicale est très faible et diffuse sur les cellules Caco-2. L'analyse en microscopie confocale a révélé de nombreuses bactéries présentes de façon diffuse dans la monocouche épithéliale des co-cultures. Aucune bactérie n'a été retrouvée dans les monocouches de cellules Caco-2 (manuscript soumis en collaboration avec le Pr. I Autenrieth, Munich, Germany). d) Listeria monocytogenes.
Listeria monocytogenes est une bactérie Gram+ responsable d'infections alimentaires chez l'homme. Le site d'entrée intestinal de cette bactérie n'a pas été clairement défini. La bactérie se multiplie dans les plaques de Peyer et dans les entérocytes et va ensuite quitter la plaque de Peyer par le réseau lymphatique pour gagner le foie et la rate où la majorité va être détruite. Chez l'individu immunodéficient, Listeria monocytogenes se multiplie dans les hépatocytes et infecter par voie sanguine le placenta et le cerveau, responsable de méningites et d'avortements. En collaboration avec l’équipe du Pr. Pascale Cossart, nous avons étudié la translocation de Listeria monocytogenes EGD dans le système de co-culture. Les résultats préliminaires ne semblent pas aussi tranchés que ceux obtenus pour Vibrio cholerae et Shigella flexneri. Les co-cultures permettent un passage d'une très faible quantité de Listeria monocytogenes (1/1000 de l'inoculum). Il faut noter que cette bactérie n'infecte les cellules intestinales qu'à très forte dose et qu'un seul cas de pathologie intestinale a été rapporté à ce jour. Ces résultats obtenus sur le système de co-culture semblent être en accord avec des expériences réalisées in vivo chez le rat démontrant que les plaques de Peyer ne sont pas les sites d’entrée préférentiels de Listeria monocytogenes . 2) Conclusions.
Les résultats préliminaires obtenus pour chacune de ces bactéries reproduisent en culture la situation décrite in vivo. L’avantage de ce système en culture réside en ce qu’il nous a permis de permis de montrer que les interactions de ces diverses bactéries les cellules de type M (Caco-2/PPLy) sont de différentes natures. Il n'y a pas de différence dans l'adhésion (faible) de Vibrio cholerae et d’EPEC (forte adhésion) sur le pôle apical des co-cultures Caco-2/PPLy et des cellules Caco-2, alors qu'on observe une spectaculaire augmentation des sites d'adhésion de Yersinia enterocolitica . La translocation de Shigella flexneri et de Vibrio cholerae est très efficace, ce qui n'est pas le cas pour Listeria monocytogenes. L'ensemble de ces résultats favorise l'hypothèse de l'implication de récepteurs différents que nous tentons d’identifier. La méthode utilisée consiste à isoler les protéines apicales des cellules épithéliales en co-culture ou non avec des lymphocytes après biotynilation de surface et d’en obtenir des « Western blots ». Les membranes sont alors incubées avec les différentes bactéries puis intensivement lavées. Les bactéries qui restent fixées sont révélées par un anticorps spécifiques. Les premiers résultats, encourageants, montrent que Shigella flexneri, par exemple, n’intéragit qu’avec 4 protéines très distintes en terme de poids moléculaire dans les cellules Caco-2. Lorsque la même expérience est répétée en utilisant Yersinia enterocolitica, le profil des protéines cellulaires qui interagissent avec la bactérie est different, indiquant que les mécanismes d’interaction avec la barrière disgestive varient d’un entéro-pathogène à l’autre (manuscript en préparation) .
2/ Régulations transcriptionnelles dans l’épithélium intestinal associé aux follicules lymphoïdes (EAF) des plaques de Peyer (Sophia El Bahi, Elise Caliot, Eric Pringault). Coopération cellulaire au cours du renouvellement de l’épithélium intestinal. Les cellules épithéliales de la muqueuse intestinale dérivent de cellules souches pluripotentielles (Cheng et Leblond, 1974) localisées dans les cryptes, centre de la prolifération cellulaire. Des études d’animaux chimériques, obtenus par agrégation d’embryons (Schmidt et al, 1985) ou par introduction de cellules souches embryonnaires (cellules ES) dans des blastocytes (Herminston et al, 1993), indiquent que chaque crypte de souris adulte est monoclonale. Une même crypte participe au renouvellement de plusieurs villosités qui l’entourent (Gordon, 1989). Les cryptes entourant les plaques de Peyer représentent une situation particulière, puisqu’elles participent à la fois au renouvellement de l’épithélium associé aux follicules lymphoïdes (EAF) et au renouvellement de celui couvrant les villosité voisines. Ainsi, à partir d’un même anneau de cellules souches, l’hémi-crypte au contact de la lamina propria s’organise en un axe crypte/villosité sur lequel les cellules épithéliales migrent et se différencient en entérocytes absorptifs, en cellules caliciformes (productrices de mucus ) et en cellules entéro-endocrines. Sur le versant au contact des follicules, il s’établit un axe crypte/EAF sur lequel les cellules se différencient en entérocytes ayant perdu certaines fonctions nutritionnelles et de défense anti-bactérienne, et en cellules M (Savidge, 1996). Cette particularité met un accent sur l’importance du micro-environnement cellulaire au cours de la différenciation des cellules souches épithéliales.

Immunorégulation et formation des cellules M Les cellules M, d’origine épithéliale (Kernéis et al, 1996), proviennent donc de précurseurs communs à tous les types cellulaires épithéliaux de l’intestin. C’est sous l’influence du micro-environnement, que les précurseurs s’engagent dans une voie de différenciation pour donner les cellules M (Savidge et al, 1991a; Bye et al, 1984). La différenciation de l’EAF et des cellules M implique des intéractions complexes entre les cellules lymphoïdes et les cellules épithéliales cryptiques. Par injection de lymphocytes de plaques de Peyer dans la cavité péritonéale de souris SCID, qui sont déficientes en follicules et en cellules M, on observe le regroupement de follicules lymphoïdes bordés d’un épithélium comprenant des cellules M (Savidge et Smith, 1995). L’injection de lymphocytes de plaques de Peyer (PP) dans la muqueuse intestinale de souris à des sites ectopiques, induit également l’apparition de novo de PP (Kernéis et al, 1997). Deux hypothèses non exclusives, sont actuellement admises pour expliquer l’origine des cellules M. Elles peuvent être formées à partir de précurseurs d’origine cryptique, communs à tous les types cellulaires épithéliaux mais également à partir d’entérocytes différenciés (Bye et al, 1984; Savidge et al, 1991a). Dans les deux cas, les cellules des follicules lymphoïdes et/ou les facteurs qu’elles secrètent, sont nécessaires à leur formation. En effet, des observations faites chez la souris in vivo, montrent qu’après infection orale par Salmonella typhimurium, le nombre de cellules M double en moins de 12 heures (Savidge et al, 1991b). Alors que, la durée du renouvellement de l’épithélium intestinal à partir des cellules souches de crypte est d’environ de 72 heures. L’apparition de cellules M au cours d’infection est donc trop rapide pour être expliquée par leur formation uniquement à partir des cryptes. De plus, la conversion phénotypique a directement été démontrée par un système de co-culture. La présence de lymphocytes dans une monocouche d’entérocytes absorptifs différenciés de type villositaire (lignée Caco-2), induit la formation de cellules M (perte de fonctions digestives, acquisition de la capacité à transporter des particules et des micro-organismes) (Kernéis et al, 1997). Les lymphocytes B sembleraient avoir un rôle majeur dans ce processus d’immunorégulation de la différenciation des cellules épithéliales des plaques de Peyer (Ermark et Owen, 1987; Loffert et al, 1994).

Interaction mésenchyme et endoderme
De nombreuses études ont montré que le mésenchyme intestinal (futur tissu conjonctif) joue un rôle inducteur dans la morphogénèse et la cytodifférenciation de l’endoderme du tractus digestif (futur épithélium). La différenciation en entérocytes absorptifs est évaluée par la polarisation morphogénique (apparition de jonctions serrées et d’une bordure en brosse) et l’expression apicale d’enzymes digestives spécifiques (phosphatase alcaline, sucrase isomaltase). Après transplantation ectopique dans un rat adulte d’associations hétérologues mésenchyme-endoderme de foetus de rat de 15 jours, ces structures embryonnaires conduisent à la formation d’un épithélium de type villositaire (Kedinger et al, 1986). Dans l’optique d’explorer le rôle respectif des deux composants tissulaires dans la morphogénèse intestinale, des associations hétérologues d’intestin foetal ont été réalisées. Après greffe des ébauches d’intestin chimère (endoderme de rat/mésoderme de poulet et vice et verça), on observe la formation d’intestin hybride (Simon-Assmann et Kedinger, 1993). Il n’y a donc pas, dans ce cas, de spécificité d’espèce en qualité d’induction. Ces expériences montrent que les intéractions épithélio-mésenchymateuses sont nécessaires pour la maturation de l’intestin pendant l’ontogénèse. Par la suite, des systèmes de co-cultures épithélio-mésenchymateuses ont été mis au point afin de mimer les intéractions hétérocellulaires rencontrées in situ (Kedinger et al, 1987) Des micro-explants d’endodermes d’intestin de foetus de rat de 14-15 jours sont ensemencés sur un tapis pré-établi de cellules mésenchymateuses intestinales ou des cellules fibroblastiques de peau. Au bout de 24h, les explants s’implantent sur le tapis cellulaire puis forment à leur tour une monocouche. Dans cette configuration, on observe la différenciation de l’endoderme en entérocytes, ce qui n’est pas le cas lorsque les explants endodermiques sont cultivés en l’absence de fibroblastes ou qu’ils n’établissent pas de contacts directs avec les fibroblastes. Cette étude permet également de démontrer que les fibroblastes détiennent les mêmes propriétés inductrices que celles du mésenchyme. La présence d’une trame fibroblastique le long de l’axe crypte-villosité, suggère que ces interactions persistent au cours du renouvellement de l’organe adulte. La différenciation de la lignée cryptique IEC-17 en entérocytes, en présence de mésenchyme d’intestin foetal de rat, a permi d’étayer cette hypothèse (Kedinger et al, 1986). D’autre part, tout comme le mésenchyme intestinal, des fibroblastes d’intestin adulte ont également la capacité d’induire la différenciation d’endoderme en épithélium intestinal (Haffen et al, 1983).

Mise en évidence fortuite de régulations transcriptionnelles positives dans l’EAF Dans le but d’établir des lignées épithéliales par oncogénèse ciblée, l’antigène T du virus simien 40 (SV40) a été placé sous le contrôle du promoteur de la L-pyruvate kinase (L-PK). Les souris transgéniques L-PK-Tag1 présentent, pour le ciblage intestinal, une expression du transgène au niveau des entérocytes. L’addition de l’enhancer de SV40 en amont du promoteur tronqué de la L-PK a produit un changement inattendu dans le ciblage du gène immortalisant (PSVPK) (Miquerol et al, 1996). Cette construction déclenche l’expression de l’antigène T uniquement dans le noyau des cellules formant la plaque de Peyer: cellules lymphocytaires des follicules, cellules épithéliales du EAF; alors que les entérocytes des villosités ne l’expriment plus . L’expression du transgène est aussi nouvellement ciblée dans le thymus. Ce ciblage inattendu de l’antigène T, révèle que les plaques de Peyer expriment une combinaison de facteurs de transcription qui lui sont propres et qui activent ce promoteur artificiel. Jusqu’à présent, l’EAF était caractérisé au niveau biochimique par des pertes de fonctions digestives dont certaines résultent de régulations transcriptionnelles négatives (phosphatase alcaline, sucrase isomaltase). C’est donc la première fois que l’on met en évidence une régulation transcriptionnelle positive au niveau de l’EAF. Ce promoteur se révèle être un outil précieux pour rechercher les facteurs de transcription spécifiques de l’EAF et leurs gènes cibles (manuscript en préparation)..

Objectifs généraux: caractériser les facteurs de transcription spécifiques de l’EAF La mise en place in vitro du modèle d’EAF dans lequel le promoteur PSVPK est actif, ouvrira la voie de caractérisation des facteurs de transcription spécifiques du promoteur mais également des gènes qu’ils régulent. Ce travail sera facilité par l’observation d’une régulation positive au niveau du EAF, actuellement la seule décrite pour les plaques de Peyer. Nous pourrons espérer ainsi identifier des marqueurs spécifiques de l’épithélium associé aux plaques de Peyer. Ceci contribuera de façon efficace à la caractérisation moléculaire et cellulaire des cellules M, qui n’avaient été jusqu’à présent étudiées que par des méthodes morphologiques. Sachant que l’épithélium des villosités intéragit avec la lamina propria et que l’EAF est en contact avec le follicule lymphoïde, il est nécessaire d’étudier la nature des interactions entre ces deux composants et les cellules de la crypte. De telles études ne sont réalisables que sur des modèles in vitro. Ainsi il sera possible d’étudier le rôle inducteur du mésenchyme et des cellules immunitaires sur la différenciation des cellules souches, permettant de rechercher les facteurs moléculaires responsables de cette plasticité cellulaire. La lignée ICcl-2 de type cryptique (Bens et al, 1996), a donc été co-transfectée avec deux promoteurs couplés à des gènes rapporteurs: le promoteur de la sucrase-isomaltase (PSI) qui est spécifiquement activé dans les entérocytes des villosités (Markowitz et al, 1995) et le promoteur artificiel PSVPK exclusivement activé dans l’EAF. Au cours de la différenciation, nous observons les variations de l’expression des gènes rapporteurs sous le contrôle des promoteurs inductibles dans des conditions de co-culture.

Créer un outil pour contrôler par une méthode biochimique la conversion phénotypique des cellules Caco-2 en cellules M Actuellement, nous ne disposons pas de marqueurs spécifiques des cellules M. La conversion in vitro est donc évaluée par l’observation d’une diminition de l’expression d’enzymes digestives (immunomarquage de la sucrase isomaltase) ou la capacité de transport de billes de latex ou de micro-organismes. L’expression du gène rapporteur LacZ sous contrôle du promoteur SVPK par les cellules Caco-2 et ICcl2 converties, constituerait une méthode beaucoup plus rapide pour évaluer la conversion phénotypique.

Constructions des deux plasmides, chacun vecteur d’un gène rapporteur contrôlé par un promoteur tissu-spécifique La première construction a consisté à introduire le promoteur de la sucrase-isomaltase PSI (8,4 kb) dans le vecteur contenant le gène rapporteur GFP (4,5 kb) par une ligation d’extrémités cohésives. La deuxième construction a consisté à remplacer l’antigène T sous le contrôle du PSVPK (5,7 kb) par le gène rapporteur LacZ (3,5 kb) selon une ligation à bouts francs. Les constructions ont été vérifiées par digestion enzymatique. La digestion par EcoRI a permis de vérifier que le gène LacZ était bien inséré dans le sens 5’Æ3’ par rapport au promoteur. S’il était inséré dans le sens opposé, nous aurions obtenu deux fragments de taille de 2,5 kb et de 6,7 kb. Le plasmide PSVPK-LacZ n’ayant pas de gène de sélection pour son intégration dans le génôme des cellules eucaryotes, nous avons vérifié par PCR, son intégration dans les transfectants stables ICcl2 A, B et C. Les oligonucléotides choisis permettent d’amplifier un fragment de 272 pb (taille attendue) pour les trois populations. Les mêmes conditions de PCR ont été utilisées pour les témoins. Aucune amplification n’a été trouvée ni pour le témoin H2O (destiné à vérifier des contaminations éventuelles), ni pour le témoin ICcl2 non transfecté (destiné à vérifier les amplifications aspécifiques).

Transfection et co-culture de la lignée ICcl-2 -Caractérisation des cellules transfectées: Après double transfection de la lignée murine ICcl2 avec les deux vecteurs d’expression puis une période de sélection au G418, nous avons obtenu trois populations de transfectants stables A, B et C. Sur le plan morphologique, ces trois nouvelles lignées conservent les mêmes caractéristiques que celles de la lignée d’origine non transfectée. A confluence, les cellules se polarisent, développent de petites microvillosités et forment de nombreux dômes. -Mise en place des co-cultures avec les fibroblastes Bien que plus délicat, nous avons choisi comme support de co-cultures, des filtres poreux. En effet, il était décrit que lorsque les co-cultures étaient réalisées sur des lamelles, les fibroblastes finissent par recouvrir de façon irrégulière la monocouche épithéliale (Kedinger et al, 1987), ce que nous avons observé également. Ce phénomène gênerait considérablement l’observation en fluorescence du tapis épithélial mais également les techniques de quantification par scanner. En ce qui concerne les fibroblastes, nous avons d’abord évalué en condition de co-culture la quantité de cellules à déposer sur le filtre (par une gamme de 104 à 106 cellules) afin d’obtenir un tapis cellulaire confluent au bout de 6 jours. La quantité de fibroblastes qui doit être ensemencé est de 5.104 dans 200 µl de milieu de ICcl2 (dans lequel nous avons vérifié la survie et la bonne croissance des fibroblastes). Nous avons à disposition deux lignées fibroblastiques C9 et C20 fournies par Le Dr. M. Kedinger, INSERM, Strasbourg, et trois populations de la lignée épithéliale Iccl2 que nous avons doublement transfectées : A, B et C. Nous avons donc testé toutes les combinaisons de co-culture en terme de population cellulaire et en terme de temps, afin de sélectionner celles permettant d’obtenir la meilleure augmentation de l’expression de la GFP par les ICcl2 en présence de fibroblastes.

-Résultat des co-cultures avec les fibroblastes Les ICcl2 B (passages 1 à 10), ont été ensemencées sur une face inférieure du filtre. Après 12 jours de culture, 5.104 fibroblastes (passage 43 à 60) de la lignée C20, ont été rajouté ou non (filtre témoin) sur la face opposée du filtre. Après 13 jours de co-culture, les filtres fixés sont analysés en microscopie à fluorescence pour vérifier l’induction de la GFP. Ils sont ensuite scannés. La quantification en unité arbitraire (UA) a été réalisée sur trois champs de 2 mm2 chacun, pris aléatoirement sur les filtres témoin et de co-culture. Les niveaux d’expression en GFP sont codés selon une échelle de couleur qui va du noir, (niveau en GFP nul) au rouge-blanc (niveau en GFP maximal). La présence de fibroblastes augmente l’expression de la GFP de 25,9 ± 18,4 UA à 88,3 ± 23,9 UA. -Résultat des co-cultures avec les lymphocytes Inspiré du modèle de co-culture Caco-2-lymphocyte, les cellules ICcl2 B et ICcl2 C ont été cultivées pendant 14 jours sur la face inférieure du filtre. Les lymphocytes sont rajoutés ou non (filtre témoin) au contact du pôle basolatéral des cellules épithéliales. Après 4 à 6 jours de co-culture, l’analyse des filtres se fait soit par détection in situ de la ß-galactosidase soit par quantification (technique de chimioluminescence). En l’absence de lymphocyte, les cellules ICcl2 transfectées n’expriment pas la ß-galactosidase. Lorsque les lymphocytes sont rajoutés, ils se maintiennent le temps de la co-culture dans le tapis cellulaire épithélial.La présence des lymphocytes induit l’expression de la ß-galactosidase révélée par la réaction enzymatique-colorimétrique. La quantification de la ß-galactosidase par la technique de chimioluminescence conduit aux mêmes résultats. La présence des lymphocytes augmente l’expression de la ß-galactosidase d’un facteur de 1,9 et de 2,7 pour les ICcl2 B et ICcl2 C, respectivement. Transfection et co-culture de la lignée Caco-2 En culture, les cellules Caco-2 se divisent puis à confluence, elles subissent une inhibition de croissance et se différencient. Tout comme les entérocytes, elles expriment la sucrase isomaltase (SI). Ainsi, le niveau d’expression de la GFP sous le contrôle du promoteur de la SI doit être élevé dans les Caco-2 transfectées (bruit de fond). La sélection des clones transfectés a été réalisée selon trois critères: (i) bonne croissance des cellules, (ii) apparition des caractéristiques morphologiques de différenciation (jonctions serrées et dômes), (iii) expression homogène et élevée de la GFP. En fin de clonage, le rendement des transfectants stables est de 2 clones (clones 35 et 39) sur les 36 sélectionnés au départ. Le clonage cellulaire représente donc un travail de longue haleine. Les deux clones dérivent de cellules qui ont été lipofectées avec les plasmides circularisés. -Caractérisation des cellules transfectées Le clone 39 a conservé les caractéristiques morphologiques de la lignée Caco-2 non transfectée . Après confluence, il forme des jonctions serrées avec les cellules voisines et de nombreux dômes qui sont bien visibles en Contraste interférentiel . Les dômes sont la preuve d’une activité de transport vectoriel d’électrolytes et donc d’une différenciation terminale des cellules en entérocytes absorptifs. L’immuno-marquage de la villine (Costa De Beauregard et al, 1995) et de la sucrase isomaltase par immunocytochimie, permet de révéler la bordure en brosse apicale du clone 39 avec ses micro-villosités . -Résultat des co-cultures avec les lymphocytes Comme il a été décrit, les cellules Caco-2 clone 39 (passages 4 à 13) sont cultivées pendant 14 jours sur un filtre de porosité 3µm. Les lymphocytes sont rajoutés au pôle basolatéral de la monocouche épithéliale. Après 4 jours de co-culture, les filtres sont soit analysés par la réaction enzymatique-colorimétrique au X-Gal, soit utilisés pour la quantification par chimioluminescence. Les mesures sur le luminomètre (quantification de la ß-galactosidase par une réaction chimique) donnent des valeurs exprimées en unités arbitraires (RLU). Afin de normaliser les résultats et de réaliser une étude comparative, nous rapportons cette valeur à la quantité totale de protéines récupérées à partir des filtres. La présence de lymphocytes augmente le niveau d’expression de la ß-galactosidase de 2926 ± 684 RLU/µg de protéine (n=3) pour les témoins à 4389 ± 2918 RLU/µg de protéine (n=3) pour les co-cultures . Ayant à disposition deux promoteurs tissu-spécifiques: (i) le promoteur PSVPK pour l’EAF et (ii) le promoteur de la sucrase isomaltase (PSI) pour l’épithélium associé aux villosités, deux constructions de plasmides contenant ces promoteurs couplés à des gènes rapporteurs, ont été réalisées et co-transfectées dans des lignées épithéliales intestinales humaine (Caco-2) et murine (ICcl2). L’étape suivante a donc consisté à mettre au point les deux systèmes de co-culture: ICcl2-fibroblastes et ICcl2-lymphocytes par lesquels les deux promoteurs sont spécifiquement activés. Enfin, l’analyse de l’expression des gènes rapporteurs, qui reflète le niveau d’activation des promoteurs, a été réalisée par des méthodes quantitatives que nous avons mis au point: chimioluminescence pour la ß-galactosidase et scanner pour la GFP. A l’issu de ces travaux, nous pouvons conclure que: 1- les constructions intégrées dans les plasmides recombinés sont fonctionnelles.

        En effet, les résultats obtenus par les techniques de co-culture sur filtres, montrent que le promoteur de la sucrase isomaltase est bien activé en présence de fibroblastes d’un facteur de 3,4 (observé par l’augmentation de l’intensité de fluorescence de la GFP des ICcl2 co-cultivées avec des fibroblastes intestinaux par rapport aux ICcl2 cultivées seules). Cette régulation transcriptionnelle positive du PSI, suggère que les cellules de type cryptique se sont différenciées en entérocytes de type absorptifs, ce qui confirme les observations obtenues in vivo et in vitro avec un transgène comportant ce même promoteur (Markowitz at al, 1995).
        Par ailleurs, les co-cultures des ICcl2 avec les lymphocytes montrent que l’expression du promoteur PSVPK est activée d’un facteur de 1,9 à 2,7 par rapport à une simple culture des ICcl2. Ces résultats confirment la régulation transcriptionnelle positive de ce promoteur, observée dans les plaques de Peyer (PP) de souris transgéniques. Ces résultats suggèrent que sous l’induction des lymphocytes de PP ou de leurs facteurs sécrétés, les cellules de type souche se différencient en cellules de type EAF.

2- les conditions de co-culture des deux types cellulaires (ICcl2-fibroblastes et ICcl2-lymphocytes) restent à être optimisées. Ainsi, l’induction des promoteurs peut être augmentée en fonction des conditions de culture. 3- la mise au point d’un système de mesure biochimique de la conversion des cellules Caco-2 en cellules M est possible. En effet, les co-cultures des cellules de la lignée Caco-2 transfectées avec le promoteur PSVPK et le PSI, ont montré que les lymphocytes induisent une augmentation de l’expression du gène LacZ par le clone Caco-2 n°39 d’un facteur 2 par rapport au clone cultivé seul (mesure de l’activité enzymatique b-gal). Cette augmentation d’activité est relativement faible, lorsqu’on la compare à ce qui est observé par détection in situ (colorie-mêtrie). Un nombre limité d’expériences ayant été réalisées, nous ne pouvons interpréter ce résultat sans avoir vérifié le rendement et la qualité de notre dosage. Ces résultats démontrent néanmoins que le promoteur PSVPK est activable in vitro, dans une lignée intestinale humaine co-cultivée avec des lymphocytes de plaques de Peyer.

D. INVITATIONS AUX CONGRES ET SYMPOSIUMS sept 1998- sept 1999.

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- Falk Symposium on « Intestinal mucosa and its diseases - Pathophysiology and Clinics » Titisee, Germany, Organizer Pr. M. Kagnoff, 16-17 octobre 1998. - 2nd Danone Symposium on « Fermented Food, fermentation and intestinal flora », Bonn, Germany, Organizer Dr. I Lenoir, 29-30 octobre 1998. - 10th International Congress of Immunology, session « Mucosal Immunity » , New Dehli, India, Organizer Pr. H. Kiyono, 2-6 novembre 1998. - Congrès annuel de la Société Française d’Immunologie, UNESCO, Paris, 27 novembre 1998, Organisateur Dr. F. Lemonnier, Paris. Invitation en tant que Président de la session « Développement du système immunitaire et immunités locales ». - XIIIème Journées Scientifiques du Groupe Thématique de Recherche sur les Vecteurs, Carré des Sciences, Paris, 7-8 décembre 1998, Organisateur pr. J.P. Benoît. Symposium Danone; « Fermented food, fermentation and intestinal flora. » Barcelone, Spain, 22-23 of April 1999. - Gordon Conference on Immunochemistry and Immunobiology, Il Ciocco, Barga, Italy, 30 mai-4 juin 1999, « M cell differentiation and function in the gut », organizer Dr. Dan Littman. - 4th World Congress on Inflammation, Palais des Congrès, Paris, 27-30 juin 1999, Symposium « Pathogen adhesion and mucosal immunity », Organisateur Pr. B. Vargaftig.

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PRINGAULT Eric, Chef de Laboratoire
KERNEIS Sophie, Assistante de Recherche CALIOT Elise, Technicienne Supérieure

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HAMZAOUI Nadim, Etudiant en Thèse
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