Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Histopathologie pour l'année 1999

Institut Pasteur


Responsable : HUERRE Michel (mhuerre@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Résumé
L’Unité d’Histopathologie étudie les interactions Hôte-Agent pathogène en pathologie humaine et/ou expérimentale. L’Unité effectue des expertises en Histopathologie humaine mais la majorité des travaux concerne l’étude des modèles expérimentaux et l’analyse des différentes étapes de la réaction inflammatoire dans un organe cible. Les programmes de l’année 1999 ont permis l’analyse de modèles impliquant des bactéries ( Hélicobacter, Shigella, Leptospira, Chlamydia), des virus (Myxovirus, Westnile, Dengue, Virus de la vallée du Rift), des parasites ( Plasmodium, Leishmania) et des champignons (Emmonsia, Fusarium, Cryptococcus). La deuxième thématique de l’Unité concerne l’analyse de gènes et de leurs fonctions en pathologie expérimentale et des mutants ou des animaux Knock-out ont été étudiés dans le laboratoire et analysés dans différents modèles de pathologie expérimentale.

Abstract

Summary
The Histopathology Unit works on interactions between numerous pathogens and their hosts in human and/or experimental pathology. Althought many expertises have been investigated, most of works were focused on experimental models of infectious diseases in order to analyse the different steps of inflammatory process in a target organ. Bacterias (Helicobacter felis, Shigella, Leptopira, Chlamydia), Viruses (Myxovirus, Westnile,Dengue fever, Rift valley fever), Parasites (Leishmania and Plasmodium) and Fungi (Emmonsia, Fusarium, Cryptococccus) have been investigated during the last year and some programs are in progress. Another field of research affect the study of genes and investigation of their function. Mutants and knock-out mice are currently studied in our laboratory and their relationship with diseases and their control by characterized genes.

Texte du rapport

L’histopathologie est l’étude des lésions tissulaires et/ou cellulaires observées en pathologie. L’Unité d’Histopathologie de l’Institut Pasteur étudie surtout l’Histopathologie infectieuse soit dans le cadre d’expertises ou de programmes de pathologie infectieuse humaine, soit dans le cadre de pathologie comparée ou expérimentale permettant une approche physiopathologique. L’histopathologie est une source d’informations importante permettant l’analyse de la réponse inflammatoire et l’étude des interactions « Hôte-Agent infectieux ». Les lésions induites par un agent infectieux diffèrent selon l’agent infectieux, ses facteurs de virulence propres, l’inoculum , la voie d’introduction mais les facteurs d’hôte sont également essentiels permettant de définir des facteurs de risque intrinsèques constitutifs ou acquis. Les travaux effectués au cours de l’année 1999-2000 sont divers traduisant l’éventail des collaborations effectuées avec les Unités de recherche de l’Institut et/ou avec le Réseau International des Instituts Pasteur. Les activités de l’Unité concernent deux grandes thématiques I- Histopathologie infectieuse: Inflammation générale et spécifique et II- Fonction et expression tissulaire des gènes.

I- Maladies infectieuses et allergiques Asthme
(Boris Vargaftig , Sok Young, Jean lefort ; Unité de Pharmacologie cellulaire) L’inflammation allergique a été étudiée par Hailé Solomon en collaboration avec le groupe de Boris Vargaftig dans un modèle d’hyperréactivité bronchique à l’ovalbumine chez les souris BP2. Ce modèle est considéré comme un équivalent de l’asthme humain. Les souris BP 2 ont un taux élevé d’IgE et l’hyperréactivité à l’ovalbumine induit un recrutement péribronchique de lymphocytes T CD4+ et d’éosinophiles suivis d’ une hyperproduction de mucus. Il a pu ètre démontré que l’inhibition de l’hyperréactivité et de l’éosinophilie pouvait ètre obtenu par l’administration d’un anti IgE et que la métaplasie mucipare des cellules de Clara était le mécanisme essentiel impliqué dans la production de mucus. Ce travail achevé par Hailé Solomon a fait l’objet d’une thèse de sciences.

Bactéries
Deux modèles de bactéries à tropisme digestif sont étudiés dans l’Unité depuis plusieurs années: Hélicobacter pylori (Hp) et Shigella (Sh). Ces pathogènes interviennent respectivement au niveau de l’estomac et du colon et ont développé des mécanismes de pathogénicité (résistance à un PH acide et ilot de pathogénicité Cag A et Vac A pour Hp, adhérence, micro-invasion et toxine pour Sh).

Hélicobacter
R. Ferrero, A. Labigne, Unité de Pathogénie Bactérienne des Muqueuses Helicobacter résiste au PH acide de l’estomac et est responsable en pathologie humaine d’ulcères gastro-duodénaux et de gastrite chronique dont l’importance est reconnue en santé publique. On dispose d’un modèle expérimental permettant l’étude de la réponse lymphocytaire pariétale gastrique après inoculation de différentes variétés d’Helicobacter. Les souris C57 Bl développent peu de lésion alors que les Swiss semblent extrêmement sensibles à l’infection induite par Hélicobacter felis. Après 12 à 13 mois se développe une gastrite hyperplasique avec dédifférenciation de l’épithélium pariétal et infiltration du chorion par des lymphocytes B sans lésion lymphoépithéliale associée. Ces lésions ne peuvent être interprétées comme des précurseurs de lymphome de type MALT. L’absence de réponse lymphocytaire chez les souris C57Bl suggèrent un profil Th1/Th2 en fonction de la génétique de l’hôte, résultat cohérent avec une production locale d’immunoglobulines. Ce programme s’oriente vers la recherche de cytokines in situ.

Shigella
P. Sansonetti, J. Arondel , C. Wenneras Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire

Shigella est responsable en pathologie humaine d’épisodes diarrhéiques sévères dont le substratum histologique se résume à des ulcérations/érosions de la muqueuse associées à un recrutement massif de polynucléaires neutrophiles. Le modèle expérimental est le lapin chez lequel les souches « entéroadhérentes et/ou invasives » sont étudiés. Les mutants M 90 T (invasif) et BS 170 (non invasifs) induisent des lésions bien documentées. En histopathologie le critère essentiel de l’invasion est en effet l’afflux de polynucléaires neutrophiles secondaires à la translocation des bactéries par les cellules M des plaques de Peyer, porte d’entrée préférentielle des Shigella et des Salmonella. La mise en évidence du LPS dans le chorion sous muqueux par technique immunohistochimique est également un témoin du caractère micro-invasif des souches virulentes de Shigella. Les travaux menés en histopathologie, dirigés par P. Sansonetti ont concerné cette année le rôle et la localisation de l’IL8 qui contrôle la translocation des bactéries par l’intermédiaire des polynucléaires neutrophiles. Le revêtement épithélial est capable de produire de l’IL-8 comme cela a d’ailleurs été démontré dans l’infection à Hélicobacter. Le rôle du récepteur au LPS (CD14) a été également analysé par C. Wenneras. On note un recrutement équivalent de polynucléaires neutrophiles bien que le caractère microinvasif soit plus marqué chez les animaux dont le récepteur est bloqué par un anti-CD14. La production de TNF-a est aussi nettement augmentée chez ces animaux mais aucune différence n’est notée pour les taux d’IL b. Ces résultats confirment la cinétique de production des chemokines dans le recrutement in situ de polynucléaires neutrophiles au cours de la shigellose expérimentale.

Autres bactéries.
D’autres programmes de pathogénèse bactérienne incluant des bactéries à tropisme broncho-pulmonaire ont été initiés en 1999: Bordetella pertussis agent de la coqueluche et Mycobacterium tuberculosis responsable de la tuberculose: deux bactéries dont l’organe cible est aussi la porte d’entrée. L’objectif est de tester des mutants dont le génome est connu et pour lesquels la pathogénicité (granulomes, cinétique, cytokines in situ) est peu documentée. Une autre approche consiste à analyser les granulomes induits par des constituants de parois de Mycobactéries. Enfin l’unité a étudié également des modèles de listériose, chlamydiose et leptospirose expérimentale au cours de l’année 1999-2000

Virus
Rétrovirus
( Mickaela Muller, Marysa Dias Tavarès, Françoise barre Sinoussi ; Unité de Biologie des Rétrovirus) Le modèle d’infection du singe vert par le SIV a été poursuivi. Si le macaque développe un équivalent de l’infection à VIH, le singe vert est insensible et ne présente ni symptôme ni lésion. La primo-infection induit une multiplication active du virion mais cette réplication est bloquée vers le 7/8ème jour. Au stade aigu initial et/ou au stade chronique, les ganglions lymphoïdes, le thymus et la rate ne présentent aucune lésion histologique .La recherche d’agent infectieux opportuniste est toujours négative ce qui est d’ailleurs corrélé à un taux normal de lymphocytes T CD4+. Ce programme s’oriente vers la recherche de cytokines in situ.

Virus de la myxomatose
(S. Bertagnoli, S. Boullier, Ch. Camus, Unité de Virologie, Ecole Vétérinaire de Toulouse)

La myxomatose due à un Leporipoxvirus constitue la principale infection virale des lapins domestiques et de garenne. Le rôle des gènes viraux en termes de pouvoir pathogène et d' adaptation du virus à son hôte est mal connu. Ces données sont nécessaires à la compréhension de la pathogénie de cette maladie et à la conception raisonnée de nouveaux vaccins plus efficaces et surs. La prophylaxie actuelle de la myxomatose repose en effet sur l'emploi de vaccins atténués, qui présentent un pouvoir pathogène résiduel. Dans cet objectif, plusieurs mutants de délétion ont été générés notamment dans le laboratoire de S. Bertagnoli. Leur pouvoir pathogène et la réponse immune associée ont été analysés in vivo après inoculation intra-dermique au lapin. Les résultats obtenus avec le mutant du gène mhr3 sont très significatifs. Le pouvoir pathogène du virus est considérablement réduit. Les lésions cutanées, la blépharoconjonctivite et la rhinite sont macroscopiquement nettement moins sévères. Aucune mortalité n'a été observée dans ce groupe. Nous avons constaté également la réduction de la gravité des lésions histopathologiques de la peau, et leur évolution vers la cicatrisation à J12. Ce travail a fait l'objet du mémoire de 3ème année de D.E.S.V. d'Anatomie Pathologique Vétérinaire de S. Bouchiha.

Herpès virus 8 et maladie de Kaposi
( Réseau International des Instituts Pasteur, Antoine Gessain, Unité d’Oncologie virale) La maladie de Kaposi a été décrite par un dermatologue Viennois il y a un siècle. Initialement cette pathologie était observée dans les populations juives d’Europe centrale, en Asie et en Afrique mais l’épidémie de SIDA devait profondément modifier le profil épidémiologique de cette maladie en révélant une forme épidémique. Le rôle du virus Herpès 8 a été démontré récemment et la présence du virus HHV8 est une condition nécessaire mais nullement suffisante pour le développement d’une lésion définie histologiquement. Ce programme s’intègre dans le cadre d’une ACIP intégrant les Instituts Pasteur de Bangui, Yaoundé, Cayenne et Madagascar et dirigée par P. Mauclère et A. Gessain ; le but est de rechercher l’Herpès virus 8 dans les tumeurs et la peau saine chez des patients atteints de maladie de Kaposi. Cette tumeur à cellules fusiformes est considérée comme une tumeur d’origine vasculaire. Les cellules sont d’ailleurs vimentine, CD-31 et CD-34 positifs mais actine, desmine et protéine S-100 négatifs. Le marqueur facteur VIII pourtant considéré comme un marqueur vasculaire est constamment négatif dans notre série. A. Gessain identifie l’HHV8 dans les tumeurs mais aussi dans la peau saine et a pu également caractériser les sous types (ORF 75) permettant une analyse épidémiologique moléculaire en fonction de l’origine géographique des cas.

Parasites
L’histopathologie de la leishmaniose a été étudiée en pathologie humaine et expérimentale. Le granulome de la leishmaniose est un granulome à renouvellement lent, riche en lymphocytes T CD4+, NK et en macrophages activés, granulomes étroitement corrélés au statut immunitaire du sujet réceptif et remanié par la production in situ de cytokines. Dans la vacuole du macrophage, les leishmania bien que peu nombreuses persistent longtemps permettant ultérieurement une réactivation en fonction du statut immunitaire. Il est cependant étonnant que les formes cutanées diffuses soient exceptionnellement observées chez les patients VIH+ au stade terminal. Ce qui suggère que les lymphocytes CD4+ ne sont pas le mécanisme essentiel et que d’autres facteurs sont impliqués dans le contrôle intramacrophagique des parasites. Cette étude se poursuit chez l’homme avec les Instituts Pasteur de Tunis et de Cayenne et aussi sur plan expérimental.

Une étude ponctuelle a été effectuée avec l’Institut Pasteur de Dakar sur les placentas palustres Le placenta séquestre les globules rouges parasités par Plasmodium falciparum selon un mécanisme qui fait intervenir les ICAM et le chondroitine sulfate.

Champignons
E. Drouhet et C. de Bièvre Unité de Mycologie

Plusieurs observations originales de mycoses humaines ont été analysées au cours de l’année 1999. Un cas d’Alternariose, fréquent chez les patients sous corticoides, une myocardite aspergillaire, localisation exceptionnelle et la cancérisation des lésions de chromomycose chronique, travail effectué avec l’Institut Pasteur de Madagascar. Deux observations tout à fait originales d’Adiaspiromycose induite par Emmonsia Crescens ont été décrites en collaboration avec le centre Marilannelongue. Les Emmonsia sont des champignons de l’environnement qui contaminent l’homme ou l’animal par voie aérienne ou transcutanée. Elles ont une position taxonomique incertaine compte tenu de leur diversité. Un autre cas d’Emmonsia chez un SIDA a été étudié par E. Drouhet : E. pasteuriania car cet agent infectieux a été isolé et caractérisé l’année du centenaire de la mort de Pasteur. Ce dernier cas présente l’intérêt d’être un agent pathogène nouveau et il faut rendre hommage à E. Drouhet (décédé le 1er janvier 2000) d’avoir dirigé avec enthousiasme ce dernier travail. Depuis sa publication princeps, trois nouveaux cas d’infection à Emmonsia ont été décrits en Grande Bretagne.

Cryptococcus

N. Rayhane et J.M. Cavaillon                                               Unité d’Immunoallergie
O. Lortholary, F. Dromer                                                     Unité de Mycologie

La méningite induite par Cryptococcus neoformans est la traduction d’une rupture de la barrière hémato-encéphalique. Le rôle inhibiteur de la capsule du Cryptocoque sur la migration ou le recrutement des polynucléaires est connu mais de façon générale ce processus reste minime. L’étude histologique révèle des abcès riches en polynucléaires neutrophiles et en histiomonocytes au niveau des leptoméninges dès que la barrière hémato-encéphalique est franchie. Chez les animaux KO TNFa/LTa il n’y a aucun recrutement de polynucléaires neutrophiles, ce qui est lié à l’absence de LT. On note également une production d’IL-1b et d’IL12. Le TNFa est donc une cytokine majeure dans l’infection à Cryptococcus mais LT est préférentiellement impliqué dans le recrutement des PMN.

Fusarium
F.X. Hue , M.A. Rouffault, C. de Bièvre Unité de Mycologie

Les Fusarium étaient connus en pathologie végétale ou ils sont responsables de maladies épidémiques ( fusariose de la banane, du mais) et en pathologie vétérinaire ou ils interviennent le plus souvent par l’intermédiaire de mycotoxines. En pathologie humaine les Fusarium sont responsables d’une pathologie localisée (mycétomes, onyxis, kératites) ou généralisée en particulier chez les leucémiques: le Fusarium est en effet considéré comme le 4ème agent fongique opportuniste après les Candida, Aspergillus et Cryptococcus. Le modèle de fusariose expérimentale chez des animaux neutropéniques après injection d’endoxan a été validé dans le groupe de C. de Bièvre FX Hue a mis au point une technique de PCR permettant d’identifier des séquences spécifiques de Fusarium dans une biopsie d’organe. Ce travail a d’autre part démontré qu’au cours de la fongémie, les reins et le cerveau sont les premières cibles. Ce travail dirigé par C de Bièvre complète l’inventaire des outils moléculaires disponibles dans les infections fongiques à filaments.

II- Etude fonctionnelle des gènes in vivo

vHNF1
(C. Coffinier, L. Gresh, M. Yaniv, Unité des Virus Oncogènes)

vHNF1 (variant Hepatocyte Nuclear factor 1), ou HNF1b, est un facteur de transcription précocement et largement exprimée dans les tissus épithéliaux. Cette homeoprotéine assure un rôle important dans leur différenciation. Les mutations connues dans ce géne entra"nent chez l'homme un syndrome polysystémique assez complexe et sont rencontrées dans le diabète de type MODY5. Les conséquences de l'inactivation du gène par recombinaison homologue montre que vHNF1 indispensable à la différenciation de l'endoderme viscéral, et à sa spécialisation en territoires embryonnaire et extra-embryonnaire. Chez les souris homozygotes, on observe en effet une létalité ‡ E7,5 et une nette désorganisation de l'endoderme viscéral (C. Coffinier et al 1999). La létalité précoce des embryons vHNF1-/- empèche toute analyse du rôle ultérieur de ce gène. Pour contourner ce handicap, une nouvelle lignée déficiente en vHNF1 a été établie dans le laboratoire de M. Yaniv, le système d'inactivation conditionnelle Cre/lox. Dans cette lign'e, l'inactivation de vHNF1 n'a lieu que dans les précurseurs des hépatocytes et des cholangiocytes. Il est donc possible d'étudier spécifiquement le rôle de vHNF1 dans le développement et les fonctions hépatiques. Le phénotype que nous avons observé chez ces souris révèle d'une manière très évidente la très grande importance de ce gène dans cet organe. On constate un retard de croissance important, un ictère, de nombreuses perturbations biochimiques (hyperbilirubinémie, augmentation du taux d'acides biliaires circulants, hypertriglycéridémie, hypercholestérolémie, hypercoagulabilité sanguine, anémie). Leur sont associées de sévères anomalies macroscopiques et histologiques des voies biliaires ainsi que des lésions nécrotiques des hépatocytes. L'analyse de souriceaux est en cours pour définir la nature des anomalies précoces.

hSNF5
(A. Yeivin, M. Yaniv ; Unité des Virus Oncogènes).

La protéine codée par le gène hSNF5/INI1 est une sous-unité du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF. Plusieurs observations très récentes font de hSNF5/INI1 un gène suppresseur de tumeur. Des mutations des deux allèles de ce gène, avec perte de fonction, ont été rapportées dans des tumeurs sporadiques humaines. Des mutations monoalléliques sont associées à une prédisposition familiale au cancer, avec perte somatique de l'allèle sauvage dans les cellules tumorales. Ces mutations somatiques ou constitutives sont rencontrées surtout dans des tumeurs rhabdoïdes (MRT pour Malignant Rhabdoid Tumors). Il s'agit de tumeurs très agressives, atteignant généralement l'enfant, dont la localisation est rénale, ou extrarénale dans des sites très variés. Pour aborder l'effet de hSNF5 gène in vivo, le gène murin SNF5 a été inactivé par recombinaison homologue. A l'état homozygote, l'absence complète d'expression de ce gène entraîne une létalité embryonnaire précoce. Les individus hétérozygotes développent des tumeurs avec une forte incidence, dans des localisations principalement neurales ou sous-cutanées. Leur étude morphologique et immunophénotypique apparentent effectivement ces tumeurs aux tumeurs rhabdoïdes humaines. Il existe de plus une perte d'hétérozygotie dans les tumeurs. La lignée murine SNF5+/- reproduit donc la situation des familles à mutation constitutive monoallélique de hSNF5.

Autres Collaborations
Rôle des cellules dendritiques dans l'immunité anti-bactérienne (X. Jiao., R. Lo-Man, C. Leclerc Unité de Biologie des Régulations Immunitaires)

L'induction d'une réponse T CD4+ anti-bactérienne nécessite l'intervention de cellules présentatrices de l'antigène. Deux populations cellulaires sont candidates à cette fonction. Les macrophages sont les hôtes privilégiés des bactéries intra-cellulaires et représentent par conséquent des réservoirs importants d'antigènes bactériens. D'un autre côté, les cellules dendritiques sont de meilleures cellules présentatrices des antigènes. La contribution respective des macrophages et des cellules dendritiques à la stimulation d'une réponse a été étudiée in vivo dans un sytème expérimental utilisant un BCG recombinant exprimant la protéine MalE d’E.coli. L'étude ex vivo des populations spléniques, complétée par l'analyse par immunohistochimie des coupes de rate que nous avons réalisée, démontre clairement que les cellules dendritiques sont dans ce cas les principales cellules présentatrices et que l'injection de l'antigène induit leur maturation.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

F. ALONS

Chercheurs de l'unité

M. HUERRE
L. FIETTE
M.F. SARON
J. GALABR

Stagiaires de l'unité

Hailé SOLOMON

Autre personnel de l'unité

P. AVE
M.C. CHIMY
S. MAURIN
I. PICOIS
H. KHUN
N. WUSCHE

Publications de l'unité

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