Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Génétique moléculaire de la Morphogenèse pour l'année 1999

CNRS URA 1947


Responsable : ROBERT, Benoît (brobert@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Notre laboratoire étudie les mécanismes de l'induction embryonnaire au cours du développement chez la souris. L'analyse fonctionnelle des gènes à homéoboîte Msx1 et Msx2, qui sont exprimés dans des régions d'induction, se poursuit par l'analyse de mutants que nous avons produits. Msx1 en outre apparaît exprimé dans des dérivés du somite, progéniteurs des muscles du membre et du derme dorsal. L'implication de Msx1 dans la voie de signalisation de BMP4 est étudiée au moyen de promoteurs dépendant de la tétracycline qui dirigent la production de noggin dans des souris transgéniques. Nous analysons également une polydactylie murine, Pdt. Le phénotype fait intervenir deux gènes indépendants sur le Chr 4, dont nous étudions les modalités d'interaction. Enfin, les relations entre prolifération cellulaire et morphogenèse du membre sont analysées par inhibition, in ovo, de la phosphatase PP2A chez le poulet.

Abstract

Our laboratory is involved in the study of induction during mouse development. The role of Msx1 and Msx2, two homeobox genes expressed in sites of induction, is analysed using mutants we have produced for both genes. We have further identified two somite-derived cell populations which express Msx1: limb muscle and dorsal dermis progenitor cells. Involvement of Msx1 in the BMP4 pathway is addressed using tetracycline-dependent promoters that drive noggin expression in transgenic mice. We are also analysing a mouse polydactyly, Pdt. The phenotype involves two independent loci on Chr 4. Analysis of the interactions between these is underway. The relationship between cell proliferation and limb morphogenesis is studied by inhibiting in ovo the chick phosphatase PP2A.

Texte du rapport

Le laboratoire de Génétique Moléculaire de la Morphogenèse se consacre à l'étude des mécanismes d'induction ecto-mésodermique à l'oeuvre dans l'organogenèse, et en particulier dans l'émergence et la morphogenèse du membre, chez les vertébrés.

Analyse fonctionnelle des gènes de la famille Msx (Antoine Bach, Marie-Anne Nicola, Bruno Reversade) Les gènes à homéoboîte Msx1 et Msx2 sont exprimés essentiellement dans des régions d'induction entre ectoderme et mésoderme. Msx1 a été inactivé il y a quelques années par insertion en phase du gène rapporteur nlacZ. Les mutants présentent à la naissance des défauts des dérivés du premier arc branchial (maxillaire, mandibule, bourgeons dentaires), qui sont létaux. Nous avons montré que le phénotype se met en place précocement et implique une apoptose accrue des procès maxillaires et mandibulaires. L'hypothèse la plus plausible est qu'une voie de signalisation entre ectoderme et mésoderme, qu'il reste à identifier, est altérée. Nous observons aussi une hydrocéphalie chez le mutant à la naissance. Celle-ci est probablement due à un dysfonctionnement du plexus choroïde, élément essentiel de la barrière hémato-méningée, qui est le siège d'une expression intense de Msx1.

Nous avons achevé la mutagenèse de Msx2 par recombinaison homologue. La stratégie adoptée consiste à éliminer toute la séquence codante du gène en lui substituant celle du gène rapporteur nlacZ. Les premiers descendants de la cellule ES sont nés. Un sur deux devrait porter l'allèle muté. Cependant, seul l'allèle normal est transmis. Ceci suggère que la mutation est létale à l'état hétérozygote sur le fond génétique utilisé.

Expression du gène Msx1 dans des dérivés somitiques (Benoît Robert, en collaboration avec Josiane Fontaine-Pérus, Université de Nantes) Nous avions montré, grâce au rapporteur nlacZ, qu'un nombre restreint de cellules de la lèvre latérale du dermomyotome expriment Msx1. Ces cellules ont été identifiées positivement comme des précurseurs musculaires, puisque elles expriment Pax3. L'expression de Msx1 est induite par le mésenchyme du bourgeon de membre antérieur, l'inducteur étant sans doute BMP4. Nous avons identifié un autre site d'expression, constitué de cellules progénitrices du derme dorsal qui migrent du dermomyotome. La greffe de fragments médiaux ou latéraux de somites murins Msx1+ sur le poulet montre que cette expression aussi est induite par des facteurs extrinsèques au somite, qui restent à identifier. Aucune altération n’a été observée dans les dérivés somitiques chez les mutants Msx1, mais une redondance fonctionnelle avec le gène Msx2 est possible.

Relations entre la signalisation par les BMP et l'expression des gènes Msx (Ewa Szabat) À de nombreux sites de l'embryon, on observe une forte corrélation entre l’expression de Msx1 et celle de BMP4 ou BMP2. Nous avons entrepris d'altérer de façon contrôlée l'activité de ces BMP dans l'embryon de souris, par expression conditionnelle de noggin à l'aide de promoteurs inductibles par la tétracycline. Le principe consiste à associer deux transgènes: l'un qui exprime un activateur de transcription, rtTA, actif seulement en présence de tétracycline; cet activateur peut être sous le contrôle d’un promoteur ubiquitaire (hCMV1), ou d'un promoteur permettant son expression localisée; l'autre qui exprime le cDNA d'un inhibiteur de BMP2 et BMP4 (en l'occurrence, noggin du Xénope) sous le contrôle d'un opérateur (tetO) répondant au transactivateur rtTA. Ce montage met le gène de noggin sous la dépendance de l'activateur dépendant de la tétracycline. Les vecteurs tetO-noggin ont été construits et transfectés dans des cellules ES. Douze clones indépendants ont été sélectionnés qui ne présentent pas, après différenciation en culture, d'expression spontanée du rapporteur lacZ. Il reste à démontrer que noggin peut y être induit à haut niveau en présence du transactivateur et de la tétracycline, avant d'en dériver des lignées de souris.

Étude de mutants polydactyles de la souris (Isabelle Blanc) Nous étudions une mutation nouvelle, Polydactylie (Pdt). La pénétrance de la mutation est faible et dépend du fond génétique. Le déterminisme du phénotype apparaît complexe: il fait intervenir deux gènes indépendants sur le chromosome 4, dont chacun suffit à conférer le phénotype mutant. Les modalités d'interaction entre ces locus sont en cours d'étude. Nous analysons par ailleurs des interactions géniques entre Msx1 et la mutation Hemimelic extra-toes. Le double mutant présente, à l'état homozygote, une extension considérable du domaine d'expression de Sonic hedgehog, marqueur de la zone polarisante postérieure. Corrélativement, la polydactylie est aggravée. Ce profil, jamais observé, indique que Msx1 est effectivement requis dans le bourgeon de membre.

Relations entre prolifération cellulaire et morphogenèse (André Weydert) La protéine phosphatase PP2A est impliquée dans de nombreuses activités du métabolisme cellulaire, dont la prolifération. Sa mutation chez la drosophile (twins) se traduit par des duplications du disque imaginal de l'aile. Nous avons entrepris d'inhiber l'activité de PP2A au sein du bourgeon d'aile du poulet au moyen de billes chargées d'inhibiteurs. Cette opération conduit à des agénésies sélectives et reproductibles, qui sont conformes aux cartes des territoires présomptifs du membre du poulet touchés. Il reste à démontrer si ces agénésies du membre sont dues seulement à un déficit précoce en cellules souches, qui pourrait s'expliquer par arrêt de croissance ou par apoptose, ou si des mécanismes de signalisation intercellulaire sont affectés.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Geneviève Antolini (Institut Pasteur)

Chercheurs de l'unité

Benoît Robert (Chef de Laboratoire, Institut Pasteur) André Weydert (Chargé de recherche,
Institut Pasteur)

Stagiaires de l'unité

Ewa Szabat, stagiaire post-doctorale
Isabelle Blanc, étudiante de thèse
Antoine Bach, étudiant de thèse

Autre personnel de l'unité

Marie-Anne Nicole (Ingénieur IP)
Claudine Cretenet (Agent de laboratoire IP)

Publications de l'unité

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