Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Génétique moléculaire murine pour l'année 1999

CNRS URA 1947


Responsable : AVNER Philip (pavner@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L’activité du laboratoire est organisée autour de quatre thématiques :

  1. L’inactivation du chromosome X chez la souris
  2. L’analyse génétique du diabète de type 1 chez la souris comme modèle pour des caractères sous contrôle multifactoriel et polygénique
  3. Le rôle du gène Nap1l2, lié au chromosome X, dans le contrôle de la division cellulaire des cellules neuronales
  4. Des projets portant sur l’organisation du gène murin, entrepris en collaboration avec le Génoscope (Centre National de Séquençage, Evry)

Abstract

Research in the Unit is centred around four projects :

  1. Inactivation of the mouse X chromosome
  2. Genetic analysis of type 1 diabetes in the mouse as a model for traits under multifactorial and polygenic control
  3. The role of the X-linked gene Nap1l2 in the control of neuronal cell division
  4. Mouse genome analysis undertaken in collaboration with Genoscope (Centre National de Sequençage, Evry)

Texte du rapport

RAPPORT EN FRANCAIS
Inactivation du chromosome X

L’inactivation du chromosome X, phénomène biologique extrêmement complexe, est l’une des préoccupations majeures de l’Unité de Génétique Moléculaire Murine.

L’initiation de l’inactivation qui dépend du locus Xic (X-inactivation center) inclut un processus qui permet le comptage du nombre de chromosomes X dans chaque cellule par rapport au nombre d’autosomes. Ainsi, dans une cellule diploïde porteuse de plusieurs chromosomes X, seul un chromosome X reste actif, tous les autres sont inactivés. Le chromosome choisi pour être actif est censé être protégé par un facteur hypothétique dit “ bloquant ”. Plusieurs locus, incluant le locus Xce, identifié génétiquement (X-controlling element) affectent le choix ou la probabilité que l’un ou l’autre des chromosomes X soit inactivé. Xce est distinct du locus Xist (X-inactive specific transcript) dont le transcrit, un ARN non-codant, est connu pour jouer un rôle important dans le processus d’inactivation.

L’année écoulée a vu l’achèvement, en collaboration avec le Génoscope, du séquençage du Xic murin, une région de 700 kb, ainsi que d’une partie importante du Xic bovin. L’annotation de cette séquence est actuellement en cours. La région homologue chez l’homme a déjà été en grande partie séquencée par d’autres groupes. La comparaison des séquences homologues de ces trois régions, séparées durant l’évolution par quelques 240-300 millions d’années devrait permettre de repérer les régions conservées au sein du Xic et donc fournir des indices sur les régions fonctionnelles du génome et ce, quelle que soit leur nature (codantes ou non, transcrites ou non). Ces données seront utilisées pour prédire les régions qui devront être soumises à une analyse fonctionnelle approfondie.

Le locus Xce a été redéfini, au cours de cette année, à une région de moins de 50 kb grâce à l’analyse génétique faisant appel à des animaux recombinants supplémentaires et à la caractérisation de nouveaux marqueurs polymorphes, y compris des SNP (Single Nucleotide Polymorphisme). La séquence génomique pour cette région est actuellement étudiée pour permettre l’identification de ce locus défini, au préalable, il y a trente ans, pour son rôle clé dans le processus d’inactivation.

D’autres expériences ont porté sur la caractérisation fonctionnelle d’autres éléments composant la région Xic par mutagenèse ciblée en utilisant le système cre-lox. L’analyse de la mutation originale a été affinée par une stratégie de « add-back ». Ces expériences nous ont permis d’approfondir notre connaissance du rôle de la région, au sein de Xic, située en 3’ de Xist (X-inactive Specific Transcript) qui, d’une part, contrôle l’expression de Xist et, d’autre part, se comporte comme le site d’attache du fameux facteur bloquant. Les expériences actuellement en cours doivent permettre de mieux préciser les relations spaciales entre ces deux éléments, leur nature et leur relation avec l’activité transcriptionnelle antisens récemment identifiée mais dont le rôle reste à éclaircir.

Une approche complémentaire à la caractérisation fonctionnelle de cette région en 3’ de Xist a été entreprise par transgenèse basée sur la capacité des YACs et des BACs comportant Xic à exprimer Xist et à inactiver les séquences avoisinantes si le transgène est présent en copies multiples. Des délétions ciblées dans des YACs transgénique ont permis d’identifier le rôle important joué par l’élément DXPas34 dans la régulation de l’expression et le processus d’inactivation.

La capacité des YACs en multicopies portant le Xic à inactiver les séquences voisines du site d’intégration peut mener à une monosomie complète ou partielle de l’autosome en question. Dans certains cas où le gène inactivé est sensible à la dose, c’est-à-dire haploinsuffisant, l’inactivation peut créer une phénocopie des mutations déja connues. La caractérisation des “ mutations épigénétiques ” ainsi crées est actuellement à l’étude.

Recherche sur les génomes et les modèles murins des maladies humaines

L’Unité de Génétique Moléculaire Murine a entrepris d’utiliser la souris comme modèle pour l’étude des phénotypes sous contrôle polygénique et multifactoriel. La lignée NOD représente un modèle de diabète insulino-dépendant et son étude tente de définir les facteurs génétiques impliqués dans le développement de cette pathologie (Idd) qui est connue pour dépendre à la fois de facteurs génétiques et liés à l’environnement. Nos études sont actuellement concentrées sur la caractérisation des loci de contrôle situés sur la partie distale du chromosome 6 murin. L’année écoulée a vu des progrès notables dans l’affinement de la localisation génétique grâce à la construction de souches de souris congéniques pour les régions distales du chromosome 6 très restreint.

L’identification des transcrits d’origine pancréatique codés au sein de l’une des régions candidates a été entreprise en utilisant plusieurs approches dont l’approche dite de sélection d’ADNc. Dans cette technique, les ADNc dérivés d’un tissu ciblé sont sélectionnés pour leur origine par hybridation contre l’ADN génomique correspondant à une région chromosomique donnée. L’établissement, l’an dernier, d’un contig de YACs pour la partie distale du chromosome 6 nous a permis d’initier ce type d’approche pour une des régions définie grâce à nos lignées congéniques.

Nous avons, de plus, poursuivi l’étude des sous-phénotypes associés avec le diabète de type 1 comme moyen de réduire la complexité génétique impliquée dans l’analyse de cette maladie. L’identification des gènes codants pour les autoantigènes-cibles de la maladie identifiés par les clones T spécifiques isolés à partir d’animaux diabétiques ou pré-diabétiques semble, à cet égard, donner des résultats particulièrement prometteurs. Nous avons pu ainsi localiser une région génomique impliquée, en toute probabilité, dans le contrôle et l’expression de plusieurs antigènes. La définition moléculaire de ce locus est actuellement entreprise.

Un autre modèle murin exploité actuellement a résulté de nos études sur le gène Nap1l2 lié au chromosome X. Des mutations dans ce gène sont associées à une léthalité embryonnaire, spina bifida et exencéphalie, liée à une surprolifération des tissus neuronaux. Nous cherchons actuellement à comprendre le rôle et les mécanismes d’action de ce gène dans la régulation-tissu spécifique du cycle cellulaire.

ENGLISH VERSION

X chromosome inactivation

One of the major research interests of the Mouse Molecular Genetics Unit is X chromosome inactivation.This is a complex biological process which depends on the presence of two copies of the X-inactivation centre (Xic) and which results in the inactivation of one of the two X chromosomes present in the female cell. The process involves both the sensing and counting of the number of X chromosomes in the cell in relation to the autosomal complement. The X chromosome chosen to remain active is thought to be protected by an as yet hypothetical blocking factor. Several genetic elements including the genetically identified locus Xce (X-controlling element) seem to be able to affect the choice or probability of which X chromosome will be chosen to be inactivated. Xce is distinct from Xist (X-inactive specific transcript) which codes for a non-coding RNA and which plays a major role in the initiation of the inactivation process.

This past year the Unit has continued its collaboration with the Genoscope, concerning the sequencing of some 800 kb of of the mouse Xic region as well as several hundred kilobases of the syntenic region in the cow. The homologous region in the human has already been sequenced in large part by other groups. Annotation of these sequences is currently underway. The comparison of the homologous region of these species separated evolutionarily by some 240-300 million years should allow both conserved coding and regulatory regions playing a role in Xic function to be identified. Regions identified for their potential interest will be wetbench analysed for their function.

The candidate region for the Xce locus has been refined in the course of the year to a region of less than 50kb based on the analysis of additional critical recombinants and the characterisation of novel polymorphic markers including SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). The genomic sequence for the candidate region is currently under study and should hopefully allow molecular characterisation of this locus which was first identified some thirty years ago.

Other experiments undertaken in the laboratory are aimed at the functional identification and analysis of the various components of the Xic by targeted mutagenesis using the cre-lox system. This approach has allowed us to define a region lying 3' to Xist which both controls Xist expression and the counting process, possibly functioning as a binding site for the hypothesised 'blocking' factor. The analysis of the original deletion is currently being refined by an add-back strategy. Additional information regarding the region 3' to Xist has come from transgenesis experiments. We have shown large capacity vectors such as BACs and YACs isolated from the Xic region and including Xist are capable of inactivating genes flanking the site of insertion when present as multicopy arrays. Deletions targeted into such YACs have allowed the critical role played by a repeat element, the DXPas34 locus, in this process to be defined.

The capacity of YACs in multicopy arrays to inactivate flanking autosomal sequences leads on many occasions to partial or complete monosomy of the autosomy in question. In cases where the chromosome contains genes which are haploinsufficient or dose dependent this inactivation can lead to the creation of a phenocopy of already known mutations. Several such cases are currently under study.

The Unit has recently initiated studies aimed at characterising the chromatin structure of the Xic region prior to, and at the onset of X-inactivation.

Genome Research and Mouse Disease Models

A second interest of the Unit concerns the study of mouse phenotypes under multifactorial and polygenic control. We have taken as our prototype type 1 diabetes for which the NOD mouse represents an interesting model. Our studies are aimed at defining the genetic factors (Idd) implicated in this pathology which is known to depend on a complex interaction between environmental and genetic factors. At present our studies are concentrated on the characterisation of Idd loci controlling diabetes susceptibility/resistance locating to the distal part of mouse chromosome 6. The past year has seen major advances in the definition and localisation of the loci concerned through the construction of mice strains congenic for progressively smaller regions of distal mouse chromosome 6. The identification of pancreatic transcripts encoded by genes lying within the candidate region defined by our congenic strain analysis, and which may be candidates underlying the globally defined phenotypes, is underway using amongst other approaches, cDNA selection. In this letter technique cDNAs derived from a tissue are hybridised against genomic DNA corresponding to a given chromosomal region, allowing selection of cDNAs originating from the region in question. We have exploited a YAC contig that we have established which covers our candidate region on the distal part of chromosome 6.

We have also continued our studies on sub-phenotypes associated with type 1 diabetes as a means of reducing the genetic complexity underlying the disease. The identification of the genes coding for target autoantigens identified by T-cell clones isolated from diabetic or pre-diabetic animals appears a particularly promising approach and has allowed us to identify a region of the mouse genome concerned in the regulation of the expression of several such antigens. The molecular analysis of the region(s) is underway.

Another mouse disease model currently being exploited has resulted from studies on the X-linked Nap1l2 gene. Mutations in this gene are associated with embryonic lethality, spina bifida and exencephaly linked to an over proliferation of neuronal cells. Current experiments are aimed at understanding the role and mechanism of action of this gene in tissue specific cell cycle regulation.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

DEMOND Anne

Chercheurs de l'unité

AVNER Philip (Chef d'Unité - INSTITUT PASTEUR, CNRS - DR1) CLERC Philippe (INSTITUT PASTEUR - CR)
HEARD Edith (CNRS - CR1)
ROUGEULLE Claire (CNRS-CR2)

Stagiaires de l'unité

BOURDET Agnès (Stagiaire pré-doctorale MRT) DEBRAND Emmanuel (Stagiaire pré-doctoral 1/2 poste ATER-P6) GRIMM Christina (Stagiaire post-doctorale DAAD) MISE Natan (Stagiaire post-doctoral Bourse d’Accueil CNRS) MOREY Céline (Stagiaire pré-doctorale MRT) PRISSETTE Marine (Stagiaire pré-doctorale MRT) ROGNER Ute (Stagiaire post-doctorale CEE)

Autre personnel de l'unité

ARNAUD Danielle (CNRS - Ingénieur)
BOUCONTET Michelle (IP - Agent de labo) MAZARS Séverine (IP - Agent de labo - mi-temps) CHUREAU-POMMIER Corinne (IP - Technicienne sup) DEMOND Anne (IP - Secrétaire de Direction - mi-temps)

Publications de l'unité

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