Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Génétique des Interactions macromoléculaires pour l'année 1999

CNRS 2171


Responsable : JACQUIER Alain (jacquier@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Nous étudions divers aspects du devenir des ARN chez la levure Saccaromyces cerevisiae. Nous avons utilisé de manière extensive une approche génomique qui utilise le double-hybride pour définir des réseaux d'interactions protéiques. Cela nous permet d'associer de nouveaux facteurs de fonction inconnue à des voies métaboliques données telles que la maturation, la dégradation ou le transport des ARN. Nous utilisons maintenant des approches génériques complémentaires pour caractériser plus en détail ces gènes. En particulier, nous appliquons la méthode "TAP" (Tandem Affinity Purification) afin de valider biochimiquement et d'étendre les complexes identifiés par le double-hybride. Nous développons également une méthode de cribles génétiques appelée "cribles de co-létalité". L'un des intérêts majeurs de cette approche est de mettre en évidence des liens fonctionnels entre les gènes alors que les deux approches précédentes identifiaient des liens physiques entre les protéines. Enfin, les gènes sélectionnés par ces approches génériques sont étudiés en détail par des tests plus spécifiques afin d'identifier leur fonction biochimique et cellulaire.

Abstract

Our research interest is focused on nuclear RNA metabolism in Saccaromyces cerevisiae. One of our major effort was the development and use of a genomic approach using the two-hybrid technique to define networks of protein interactions. It leads to the identification and characterization of novel factors of unknown functions, now found linked to specific metabolic pathways in these networks (for example to RNA maturation, RNA turnover or transport). We now develop several alternative generic approaches to further characterize these genes with the aim of identifying their biochemical and cellular function. In particular, we adapt a new biochemical approach, using a tandem tag purification technique, to efficiently purify biochemical complexes linked to the products of these genes. We also apply a genetic approach called co-lethality screens. One of the major interest of this approach is that it provides functional links between genes while the first two approaches provide physical links between gene products. These approaches are thus highly complementary. Finally, the function of the genes selected by these generic approaches are analyzed in more details by applying more specific assays.

Texte du rapport

THEME 1 : Elaboration d'un réseau d'interactions protéiques centré autour du métabolisme des ARN messagers.

Depuis quelques années, nous exploitons une approche génomique du double hybride mise au point dans notre laboratoire. Cette approche consiste à utiliser comme appâts primaires des protéines connues pour être impliquées dans le métabolisme des ARN. L’analyse exhaustive de la banque double-hybride nous permet de classer les candidats en catégories de valeurs prédictives différentes. Parmi les proies sélectionnées, celles ayant les valeurs prédictives les plus fortes sont utilisées à nouveau comme appât. Ces cribles réitératifs permettent la constitution de réseaux d’interactions connectant des facteurs inconnus avec des facteurs connus.

En 1999, ces analyses nous ont permis d'identifier des liens entre l'épissage, le transport et la dégradation des ARN. Par exemple, nous avons montré que de petites protéines impliquées dans l'épissage nucléaire, appelées Lsm, font également partie d'un complexe cytoplasmique de dégradation des ARN messagers.

D'une manière générale, nous disposons maintenant d'une banque de donnée d'interactions pour plus de 150 protéines appâts. Ces appâts ayant initialement été choisis autour de voies métaboliques proches (le métabolisme des ARN), un grand nombre de ces protéines sont connectées de manière multiple, créant ainsi de nombreux réseaux d'interactions locaux.

Afin de valider biochimiquement les interactions double hybride et d'étendre ces réseaux d'interactions, nous utilisons maintenant la technique "TAP" (Tandem affinity Purification) qui est particulièrement appropriée à la levure. Les protéines isolées au sein des complexes purifiés sont identifiées par spectrométrie de masse. Ces études sont réalisées en collaboration avec le Laboratoire de Chimie Structurale des Macromolécules dirigé par Octavian BARZU.

D'autre part, nous voulons maintenant tirer parti de ces données en réalisant des analyses fonctionnelles plus ciblées.

THEME 2 : Caractérisation de nouveaux facteurs impliqués dans le métabolisme des ARN.

Certains des facteurs identifiés lors des analyses présentées ci-dessus ont une fonction encore inconnue. Leur appartenance à un réseau d'interactions local suggère leur implication dans une voie métabolique donnée. Afin de poursuivre leur analyse fonctionnelle, nous appliquons dans un premier temps un certain nombre de tests génériques tels que l'analyse du phénotype des cellules dans lesquelles le gène a été invalidé, la localisation cellulaire de la protéine à l'aide de fusions GFP, ou des tests de co-létalité avec des facteurs impliqués dans la même voie métabolique. Ensuite, des tests fonctionnels spécifiques de la voie métabolique suggérée sont appliqués.

Dans un grand nombre de cas, aucun phénotype simple ne permet d'associer une fonction au gène étudié. Pour cette raison, nous développons dans le laboratoire des cribles de co-létalité afin de trouver des liens fonctionnels entre le gène étudié et des gènes connus. Dans cette approche, le gène analysé est muté et nous recherchons des mutations secondaires dans d'autres gènes qui entraînent un phénotype de létalité uniquement en présence de la première mutation. Cette approche est très complémentaire des approches précédentes qui mettaient en évidence des liens physiques entre les facteurs protéiques.

THEME 3 : Utilisation de la technique triple-hybride pour mettre en évidence des interactions ARN-protéines.

Nous avons récemment adapté la technique du triple-hybride pour la recherche in vivo d'interactions ARN-protéines afin d'en diminuer le bruit de fond. Nous appliquons maintenant cette technique à de petits motifs ARN, notamment bactériens, afin de rechercher leurs partenaires protéiques.

THEME 4 : Etude de la maturation des ARN par l'endonuclease double-brin Rnt1p.

Nous avons montré que la protéine Rnt1, homologue de la RnaseIII bactérienne, participe à la maturation d’un grand nombre de petits ARN stables non traduits. L'analyse comparative d’un grand nombre de substrats pour cette protéine a permis d’identifier un consensus, la tétraboucle AGNN. Cette séquence est importante fonctionnellement, car, quand on mute ce signal, on abolit totalement le clivage par Rnt1. Nous avons de plus montré, en utilisant un système modèle purifié constitué par un substrat modèle en épingle à cheveu et la protéine Rnt1p recombinante exprimée chez E.coli, que la tétraboucle constitue le site de reconnaissance primaire de la protéine. Le site de clivage par Rnt1p est situé dans l'ARN double brin. La position de ce site est principalement déterminée par sa distance par rapport à la tétraboucle. Ces études sont maintenant poursuivies par Guillaume Chanfreau à l'Université de Californie à Los Angeles.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

LABOUISE Odile, IP

Chercheurs de l'unité

CHANFREAU Guillaume     CR2 CNRS, en détachement à compter du 1.10.1999
FROMONT Micheline       CR1 CNRS
JACQUIER Alain          DR2 CNRS
LEGRAIN Pierre          DR2 CNRS, en disponibilité à compter du 1.03.2000

Stagiaires de l'unité

BREARD Gwenaël          Etudiante en 1ère année de thèse, bourse CIFRE, arrivée le 2.11.99
COUSTY Anne             Stagiaire en DEUST, fin du stage le 17.12.99
DORE Laurence           Stagiaire en DEA, du 7.01.99 au 10.09.99
FERRI Laura                     Chercheur post-doctoral, fin du CDD le 31.08.99
PAILLIER François               Stagiaire en DEA, fin du stage le 9.04.99
SAVAENU Cosmin          Docteurs en médecine, préparation du DRSUS, arrivée le 1.01.2000
SIMON Adeline           Ingénieur de l'INRA, fin du CDD le 31.12.1999

Autre personnel de l'unité

DECOURTY Laurence       Technicienne Supérieure de Laboratoire en CDI depuis le 1.06.1999
RICARD Florence         Ingénieur Bioinformaticienne en CDD du 30.10.98 au 29.10.99, en CDI depuis le 6.03.2000

Publications de l'unité

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