Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Génétique mycobactérienne pour l'année 1999

Institut Pasteur


Responsable : GICQUEL Brigitte (bgicquel@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Causée par les mycobactéries du complexe tuberculosis, la tuberculose continue de poser un problème majeur de santé publique: elle est responsable d’environ trois millions de morts par an. Le BCG, seul vaccin disponible actuellement contre cette maladie, est d’une efficacité relative. Quant à l’utilisation des antibiotiques, elle se heurte à l’apparition de souches résistantes. Dans ce contexte, l’Unité de Génétique Mycobacterienne s’intéresse à la caractérisation des facteurs de virulence de M. tuberculosis et aux réponses immunitaires induites par cette bactérie et le BCG. Ces études pourraient conduire à l’identification de cibles thérapeutiques pour de nouveaux agents antituberculeux, et de composants de la bactérie suceptibles d’entrer dans la composition de nouveaux vaccins, voire d’une souche atténuée plus efficace que le BCG. L’unité étudie également la possibilité d’utiliser des souches de BCG portant des gènes étrangers pour protéger contre d’autres maladies, telles que le SIDA.

Abstract

Caused by mycobacteria of the Tuberculosis complex, tuberculosis still represents a major problem of public health: it is responsible for about three million deaths each year. BCG, the only vaccine available today is of a relative efficacy. As for the use of antibiotics, it faces the emergence of multiresistant strains of bacteria. This unit is involved in the characterisation of M. tuberculosis virulence factors, and of the immune responses induced in the host by this bacterium and BCG. This work could lead to the identification of targets for new drugs against tuberculosis, of bacterial components to include in a new vaccine, or even to the isolation of a new attenuated strain, more efficient than BCG. The Unit is also studying the possibility to use recombinant strains of BCG to protect against other diseases, such as AIDS.

Texte du rapport

ETUDE GENETIQUE DES DETERMINANTS DE VIRULENCE (Christophe Guilhot)

L'utilisation d'un vecteur thermosensible dérivé du plasmide de M. fortuitum pAL5000 et contenant le marqueur de contresélection sacB, a permis de sélectionner des événements génétiques rares chez les mycobactéries du complexe de M. tuberculosis. Ce système s'est montré très efficace pour construire des mutations par échange allélique dans des gènes de M. tuberculosis potentiellement importants pour la multiplication chez l'hôte. Ce système est d'autant plus utile que la connaissance de la séquence complète du génome de M. tuberculosis donne accès à des gènes candidats choisis pour leurs similarités avec des gènes essentiels pour la croisssance in vivo. Ce système a été utilisé pour construire, par échange allélique des souches de M. tuberculosis et de M. bovis BCG déficientes pour la synthèse des purines (mutants purC). Ces mutants sont avirulents chez la souris et le cobaye. Ils confèrent chez le cobaye un certain niveau de protection contre une épreuve par la souche M. tuberculosis virulente de type sauvage. Ce vecteur ts/sacB a également permis de construire des banques de mutants de transposition de M. bovis BCG et M. tuberculosis. Une première banque de 7000 souches dérivées de M. tuberculosis a été ordonnée et utilisée pour rechercher par PCR des mutations dans des gènes candidats. Une seconde banque de 4000 souches a été obtenue en utilisant un transposon marqué. Celle-ci a permis d'utiliser la méthode STM (" Signature-tagged Transposon Mutagenesis ") pour rechercher directement chez la souris des souches atténuées pour la virulence. Environ 2000 souches ont été criblées pour leur capacité à se multiplier dans les poumons de souris. Seize mutants atténués ont été sélectionnés et les mutations qu'ils contiennent caractérisées. Quatre des insertions différentes sont localisées dans un groupe de 13 gènes impliqués dans la biosynthèse et le transport d'un lipide de la capsule de M. tuberculosis. Le rôle de ce lipide dans la pathogénèse est en cours d'étude plus approfondie en collaboration avec l'équipe de M. Daffé de l'Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale du CNRS à Toulouse. Deux des mutants atténués chez la souris se sont avérés également atténués chez le cobaye. Ils confèrent un certain niveau de protection contre la tuberculose après une épreuve par M. tuberculosis chez le cobaye. Ces études, comme celles relatives aux souches PurC, sont effectuées en collaboration avec l'équipe de D. McMurray de Texas A & M University à College Station (U.S.A.). Les souches atténuées de M. tuberculosis sont étudiées dans le contexte du "TB vaccine cluster" de la commission Européenne coordonné par Brigitte Gicquel: http://www.pasteur.fr/EC_TBvaccine/

OUTILS GENETIQUES POUR ETUDIER L'EXPRESSION DIFFERENTIELLE ET L'EXPORTATION CHEZ LES MYCOBACTERIES (Brigitte Gicquel)

Le gène codant pour la protéine fluorescente de méduse, GFP, a été utilisé comme gène rapporteur pour identifier les gènes de M. tuberculosis induits au cours de la croissance intra-macrophagique. Le gène de contre sélection sacB a été placé en aval du gène codant pour la GFP et en fusion transcriptionnelle. Une banque d'ADN a été construite par clonage au hasard de fragments d'ADN de M. tuberculosis en amont du gène codant pour la GFP et transférée dans le BCG. Les clones de BCG induits pour la production de GFP après infection de macrophages ont été sélectionnés par triage de macrophages fluorescents. Les clones de BCG possédant des promoteurs en fusion avec le gène codant pour la GFP et le gène sacB, et induits dans des conditions de croissance acellulaire ont été contre sélectionnés par croissance en présence de sucrose in vitro.Vraisemblablement, dans ces conditions de croissance, l'expression du gène sacB conduit à l'accumulation de lévanes qui sont toxiques pour les mycobactéries. La sélection de clones de BCG hébergeant des promoteurs induits dans des conditions de croissance intracellulaire a permis l'identification de sept gènes de M. tuberculosis dont l'expression est induite d'un facteur de deux à trois après infection de macrophages. Ces gènes pourraient jouer un rôle important au cours de la pathogénèse. Cette étude est actuellement poursuivie en collaboration avec l'équipe de W. Britton du Centenary Institute de Sydney (Australie). Les protéines secrétées et les protéines exportées restant ancrées à la surface du bacille de la tuberculose sont à l'interface entre les mycobactéries et l'hôte et jouent varisemblablement un rôle important dans la pathogénèse comme cela a deja été montré chez de nombreuses bactéries pathogènes. Le gène phoA a été utilisé pour étudier l'exportation des protéines chez les mycobactéries. Ce gène code pour une phosphatase alcaline qui n' est active qu'après translocation à travers la membrane cytoplasmique. Plusieurs banques d'ADN de M.tuberculosis ont été construites dans un plasmide portant ce gène rapporteur. Ce système est utilisé pour rechercher les protéines exportées de M.tuberculosis et pour étudier la régulation de leur expression. Ceci à permis de dresser un catalogue d'une trentaine de gènes de M. tuberculosis codant pour des protéines exportées. Celles-ci sont actuellement à l'étude. L'une d'entres elles, Erp, a été plus particulièrement analysée et il a été montré en utilisant des macrophages en culture et le modèle murin de la tuberculose qu 'il s'agissait d'un facteur de virulence majeur de M. tuberculosis.

CARACTERISATION FONCTIONNELLE DE FACTEURS DE VIRULENCE (Jean-Marc Reyrat)

L'utilisation de la phosphatase alcaline (voir plus haut), de méthodes génétiques telles que la mutagénèse insertionnelle étiquetée, ou bien encore de l'outil informatique à permis d'identifier un certain nombre de gènes de virulence. Plusieurs loci de virulence sont actuellement à l'étude dont Rv1395 un activateur de transcription de la famille AraC/XylS et enfin Erp (Rv3810) une protéine secrétée par M. tuberculosis. L'un des loci de virulence est étudié en collaboration avec A. Hance de l'Unité 82 INSERM, localisée à l'hôpital Bichat . Erp est une protéine secrétee par les bactéries du complexe tuberculosis identifiée grâce à la méthodologie de la phosphatase alcaline. Chez M. tuberculosis, l'inactivation du gène erp par échange allélique a conduit à une atténuation majeure de la virulence aussi bien in vitro, en utilisant des cellules macrophagiques en culture, qu'in vivo dans le modèle murin de la tuberculose. Nous avons récemment montré que Erp est une protéine ubiquitaire des mycobactéries. Cette protéine secrétée est constitué de trois domaines. Le domaine central consiste en une répétition en tandem du motif PGLTS. Cette région centrale est le domaine le plus variable entre espèces : de 5 répétitions dans le cas de M. leprae et jusqu'à 24 pour M. xenopi. Une analyse de la région génomique encadrant le gène erp montre que celui-ci se situe dans une région comprenant principalement des gènes de biosynthèse de la paroi. Nous analysons à l'heure actuelle le rôle de Erp dans la structuration de la paroi mycobactérienne et le rôle éventuel du nombre de répétitions PGLTS dans la virulence de M. tuberculosis.

BCG ET NOUVEAUX VACCINS (Nathalie Winter)

L'efficacité du BCG contre la tuberculose pulmonaire est variable suivant les populations vaccinées et un vaccin anti-tuberculeux plus efficace est nécessaire. Cependant, le BCG présente de nombreux avantages pour la construction de nouveaux vaccins recombinants. Grâce au développement d'outils génétiques, notamment dans notre laboratoire, il est possible d'introduire des gènes hétérologues dans le BCG et de construire des souches de BCG recombinantes (rBCG). Les macaques infectés par VIS développent une pathologie proche du SIDA humain permettant donc d'évaluer de nouveaux candidats vaccins contre VIH. Les gènes nef , gag (p26) et env de VISmac251 ont donc été exprimés dans le BCG. Un mélange des trois souches de rBCG construites a été administré à des souris Balb/c et nous avons observé l'induction de réponses immunitaires de type cellulaire et humoral contre les trois antigènes recombinants. Les muqueuses constituent la voie d'entrée principale de nombreux agents pathogènes. Pour le SIDA en particulier, les voies de transmission rectale et cervico-vaginale représentent les modes de contamination principaux. Le BCG étant capable de transiter par les cellules M présentes dans les muqueuses intestinale et respiratoire, il parait être un bon vecteur pour l'administration par voie mucosale et l'induction de réponses immunitaires locales. Nous avons en effet observé qu'après administration par voie mucosale à la souris, le mélange de trois souches de rBCG exprimant les gènes de VISmac251 était capable d'induire des réponses immunitaires locales (dans la muqueuse intestinale) et systémiques (dans la rate) contre les trois antigènes recombinants.

L'étude de l'immunogénicité du mélange de trois souches de rBCG chez le macaque a été entreprise. Les animaux ont été inoculés par voie intradermique, la voie classique d'administration du BCG chez l'homme, puis un rappel par voie muqueuse (orale ou rectale) a été administré. Les animaux ont ensuite été soumis à une inoculation d'épreuve par le virus VISmac251 administrée par voie rectale. L'étude des réponses immunitaires cellulaires et humorales induites localement et dans le compartiment systémique avant et après épreuve virulente est en cours. La protection induite par le mélange des souches est également en cours d'évaluation. Ces études sont effectuées en collaboration avec les équipes de A. Venet (LaboratoireVirus, Neurones et Immunité, Faculté de Médecine Paris Sud, le kremlin Bicêtre) et de R. Legrand (Service de Neurovirologie, Comissariat à l'Energie Atomique, Centre d'Etudes de Fontenay-aux-Roses).

Le laboratoire s'intéresse également aux mécanismes d'induction de la réponse immunitaire après administration du vaccin BCG. Dans ce contexte, il parait important d'étudier l'intéraction entre BCG et cellules dendritiques, les cellules présentatrices d'antigène professionnelles les plus aptes à activer les lymphocytes T naïfs. Plusieurs travaux ont été entrepris sur ce sujet, notamment in vitro soit sur des lignées établies de cellules dendritiques soit à partir de cellules dérivées de précurseurs de moëlle osseuse. In vivo, grâce à des systèmes rapporteurs tels que le gène gfp exprimé chez le BCG, les intéractions entre BCG et cellules dendritiques sont également étudiées après administration du BCG par voie mucosale (vaginale et rectale) à la souris.

Le rôle protecteur du BCG contre l'allergie a été étudié en collaboration avec l'équipe de B. Vargaftig. en utilisant un modèle murin.

ENSEIGNEMENT

L'Unité est un laboratoire d'accueil du "Marie Curie Host Fellowship" de la Commission Européenne. "Unravellling Mycobacterium pathogenicity. MCFH-1999-00615". http://www.cordis.lu/improving/

RÉSEAUX INTERNATIONAUX

L'unité fait partie du "TB vaccine cluster" et de l'action concertée "Molecular Epidemiology and Control of Tuberculosis" de la commission Européenne.

http://www.pasteur.fr/EC_TBvaccine/

Mots-cles: mycobactéries, pathogénicité, virulence, tuberculose.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

SINNO Helena, IP, hsinno@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

GICQUEL Brigitte, chef de l'unité IP, bgicquel@pasteur.fr GUILHOT Christophe, chargé de recherche IP,cguilhot@pasteur.fr REYRAT Jean-Marc, chargé de recherche INSERM, jmreyrat@pasteur.fr WINTER Natahalie, chargé de recherche IP, nwinter@pasteur.fr

Stagiaires de l'unité

BOURGUIN Isabelle, Post Doc, bourguin@pasteur.fr CAMACHO Luis Reinaldo, Thèse, lcamacho@pasteur.fr DEMENDONCA LIMA Leila, Post Doc, lmlina@pasteur.fr MEDERLE Isabelle, Thèse, imederle@pasteur.fr RAYNAUD Catherine, Post Doc, craynaud@pasteur.fr TRICCAS Jamie, Post Doc
GOGUET DE LA SALMONIERE Yves Oliver, thèse PEREZ Esther, thèse
PETIT Stéphanie, DEA

Autre personnel de l'unité

AUBERT-PIVERT Elisabeth, ingénieur IP epivert@pasteur.fr ENSERGUEIX Danielle, technicienne supérieure I.P,dsensegueix@pasteur.fr RAUZIER Jean, technicien supérieur I.P., jrauzier@pasteur.fr CHARLES Patricia, agent technique d'exploitation I.P.

PERSONNEL DU LABORATOIRE DU BCG

LAGRANDERIE Micheline, ingénieur IP, mlagrand@pasteur.fr

LABORATOIRE DE PRÉPARATION COMMUN AVEC LE LABORATOIRE DE RÉFÉRENCE DES MYCOBACTÉRIES

GILLARD Marie-Renée, responsable de préparation I.P. LEMAIRE Jocelyne, agent de laboratoire, I.P. LALLEMAND Catherine, aide de laboratoire I.P. SIROIT Evelyne, agent de laboratoire I.P.

Publications de l'unité

En cas de problèmes ou de remarques concernant ce serveur Web, écrire à rescom@pasteur.fr. Cette page a été modifiée pour la dernière fois le Mercredi 24 Mai 2000 à 8 h 22 (Temps Universel) .