Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Génétique des Déficits sensoriels pour l'année 1999

CNRS URA 1968


Responsable : Petit Christine (cpetit@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Etude de l’anosmine-1 responsable du syndrome de Kallmann de Morsier. Localisation chromosomique et identification de gènes responsables de surdités isolées et syndromiques, s’appuyant sur l’isolement de transcrits d'expression spécifique ou préférentielle dans l'oreille interne. Caractérisation fonctionnelle des protéines correspondantes, utilisant comme modèles, la souris et le poisson-zèbre. Étude moléculaire, clinique et épidémiologique de la surdité isolée prélinguale due à l'atteinte du gène codant pour la connexine-26.

Abstract

Properties of anosmin-1, the protein responsible for Kallmann de Morsier syndrome. Chromosomal localisation and identification of genes responsible for isolated and syndromic hearing loss, based on the identification of transcripts specifically or preferentially expressed in the inner ear. Functional characterisation of the corresponding proteins, using the mouse and zebra-fish, as animal models. Molecular, clinical and epidemiological study of the prelingual isolated deafness due to defects in the connexin-26 gene.

Texte du rapport

DÉFICITS NEUROSENSORIELS HÉRÉDITAIRES CHEZ L'HOMME

L'activité du laboratoire est centrée sur la physiopathologie moléculaire des déficits neurosensoriels héréditaires chez l'homme, principalement celle des atteintes auditives. Outre leur intérêt au plan médical, ces études constituent une voie d'approche du développement des organes sensoriels et de la différenciation des fonctions sensorielles. Les gènes responsables de 9 déficits sensoriels héréditaires ont été isolés au laboratoire : (i) un déficit de l'olfaction associé à un hypogonadisme hypogonadotrope, la forme liée au chromosome X du syndrome de Kallmann de Morsier, (ii) deux formes de cécité due à une rétinopathie pigmentaire, accompagnée d'une surdité profonde, les formes 1B et 1C du syndrome de Usher, (iii) une surdité syndromique qui comporte des anomalies morphologiques de l'oreille et des anomalies rénales, le syndrome branchio-oto-rénal, (iv) cinq formes de surdité non syndromique (ou isolée). Pour plusieurs de ces gènes, les fonctions des protéines pour lesquelles ils codent sont étudiées. Afin d'accélérer le processus d'isolement des gènes responsables de surdité, nous nous sommes engagés dans l'isolement de gènes dont l'expression est restreinte à l'oreille interne.

Le syndrome de Kallmann de Morsier lié au chromosome X (Olivier Ardouin, Jean-Pierre Hardelin, Jacqueline Levilliers, Nadia Soussi-Yanicostas)

Ce syndrome associe une anosmie (déficit de l'olfaction) et une absence de puberté spontanée. L'hypogonadisme est dû à un déficit en GnRH, hormone hypothalamique qui contrôle via l'hypophyse le développement pubertaire des gonades. Nous avons isolé le gène KAL-1 responsable de la forme liée au chromosome X du syndrome. La protéine codée par ce gène, que nous avons appelée anosmine-1 en référence au déficit de l'olfaction présent dans la maladie humaine, est une glycoprotéine extracellulaire de 100 kDa, de distribution régionalisée au sein de certaines matrices extracellulaires pendant la période de l’organogenèse. Au cours du développement embryonnaire ultérieur, l'anosmine-1 est produite par diverses populations neuronales, dont les cellules mitrales des bulbes olfactifs et certains neurones du cortex olfactif. Différentes propriétés de cette protéine ont été mises en évidence. C’est (1) une molécule permettant l’adhérence de cellules, (2) un substrat de croissance neuritique pour diverses populations neuronales. Nous avons identifié deux gènes orthologues du gène humain chez le poisson-zèbre, et avons étudié leur profil d’expression au cours du développement. Ce modèle animal pourrait constituer une alternative intéressante au modèle murin dont l’obtention se heurte à l'absence d'isolement à ce jour du gène orthologue chez la souris.

Les déficits auditifs

La surdité est le déficit sensoriel héréditaire le plus fréquent. En France, environ un enfant sur 1000 naît atteint de surdité profonde, et dans plus de 80% des cas, l'origine en est génétique. Pour 70% de ces cas, il s’agit d’une surdité isolée, et le nombre des gènes impliqués est estimé à une centaine. Dans les autres cas, la surdité est associée à d'autres symptômes, et est dite syndromique. Les surdités syndromiques sont souvent transmises sur le mode autosomique dominant, tandis que les surdités isolées prélinguales, qui entravent l'acquisition du langage parlé, sont pour la plupart des atteintes monogéniques autosomiques récessives.

Localisation chromosomique des gènes responsables de surdités isolées (Sébastien Chardenoux, Mirna Mustapha, Dominique Weil)

Nous avons surmonté les difficultés de l'analyse génétique des surdités isolées autosomiques récessives en recherchant de très grandes familles pour lesquelles l'isolement géographique, la forte consanguinité et la ségrégation du déficit auditif indiquaient qu'un gène unique devait être en cause. Dans ce but, nous avons établi un réseau de collaborations autour du bassin méditerranéen, d'abord avec des collègues tunisiens, puis libanais et grecs, et récemment iraniens, syriens et jordaniens. Nous avons ainsi localisé sur les chromosomes les deux premiers gènes responsables de surdité neurosensorielle isolée autosomique récessive, DFNB1 et DFNB2. Nous avons ensuite assigné à la région chromosomique du gène DFNB1 un autre locus, DFNA3, impliqué dans une surdité neurosensorielle transmise sur le mode dominant ; d'où l'hypothèse qu'un même gène pourrait être responsable d'une surdité dominante et d'une surdité récessive. Puis, nous avons localisé quatre autres gènes responsables de surdité autosomique récessive, trois dans des familles libanaises (DFNB9, DFNB13 et DFNB14), et un dans une famille syrienne (DFNB12), un gène responsable d’une forme dominante et les gènes responsables de deux syndromes (Usher 2B et Usher 3B).

Recherche des gènes responsables de surdité isolée

DFNB9 (M'hamed Grati, Shin’ichiro Yasunaga) Le gène DFNB9 code une protéine qui appartient à la même famille que la dysferline et la myoferline, et que nous appelée pour cette raison otoferline. Son expression dans l’oreille interne est limitée aux cellules sensorielles.

DFNB21 (Mirna Mustapha, Dominique Weil) Cette surdité est due à l’atteinte du gène qui code l’a-tectorine, un composant de la membrane tectoriale (gel acellulaire qui couvre l’épithélium sensoriel de la cochlée). Sous l’effet de la stimulation auditive, la membrane tectoriale imprime aux stéréocils des cellules sensorielles un mouvement de déflexion qui provoque l’ouverture des canaux de mécanotransduction.

DFNA2 (Aziz El-Amraoui, Jean-Pierre Hardelin) En collaboration avec un autre laboratoire (Thomas Jentsch, Hambourg), nous avons montré que le gène responsable de cette surdité code un nouveau canal potassique dépendant du voltage, KCNQ4. Ce canal est présent à la base des cellules ciliées externes de la cochlée. Dans le cerveau, il est exprimé par des neurones des voies auditives et vestibulaires.

Prévalence élevée de la mutation 35delG dans le gène codant la connexine-26, impliquée dans la surdité DFNB1 (Françoise Denoyelle, Sandrine Marlin, Dominique Weil)

Les atteintes du gène codant la connexine-26 rendent compte de plus de la moitié des cas de surdité isolée. De plus, une mutation particulière (35delG, ou 30delG) est retrouvée chez un grand nombre de patients, jusqu’à 85% dans certaines populations. Le diagnostic moléculaire de cette forme de surdité a été développé ; il permet souvent d'affirmer l'origine génétique d’une surdité en dehors de tout contexte familial évocateur, et de répondre à la demande de conseil génétique de parents entendants qui ont un enfant sourd, et souhaitent connaître le risque de récurrence de l'atteinte auditive pour les enfants à venir. Une étude prospective approfondie menée sur plus de cent familles a fourni les éléments d'une description clinique fine de cette forme de surdité. Les données obtenues ont montré la variabilité de l'atteinte auditive, même au sein d'une fratrie, et l’absence probable d’aggravation de la surdité au cours de la vie.

Recherche de transcrits spécifiquement exprimés dans la cochlée: gènes candidats pour être responsables de surdité (Stéphane Blanchard, Martine Cohen-Salmon, Michel Leibovici, Sylvie Nouaille, Elisabeth Verpy, Dominique Weil, Ingrid Zwaenepoel)

Nous avons considéré que des gènes dont l'expression est restreinte à l’oreille interne sont de bons gènes candidats pour être responsables de surdité. Afin d’isoler de tels gènes, nous avons généré des banques soustractives d’ADN complémentaire de cet organe, au sein desquelles nous avons pu identifier plusieurs transcrits spécifiques. Les protéines correspondantes ont été caractérisées. L'une, dénommée otogéline, est présente dans toutes les membranes acellulaires de l’oreille interne; l’autre, nommée otoconine, est un composant majoritaire des otoconies, structures biominérales qui couvrent les membranes acellulaires du saccule et de l'utricule. L’inactivation du gène codant l’otogéline chez la souris (collaboration avec Marie-Christine Simmler et Jean-Jacques Panthier, Maisons-Alfort) se manifeste à l'état homozygote par une surdité progressive et des troubles de l'équilibre. La membrane tectoriale présente des anomalies ultrastructurales, l'ancrage des membranes acellulaires vestibulaires (membranes otoconiales et cupules) aux neuroépithéliums sous-jacents est défectueux.

Déficit visuel et auditif associé: le syndrome de Usher (Aziz El-Amraoui, Batiste Boëda, Sylvain Ernest, Stéphane Blanchard, Sylvie Nouaille, Ingrid Zwaenepoel, Michel Leibovici, Elisabeth Verpy, Dominique Weil)

Le gène responsable du syndrome de Usher de type IB (USH1B) code la myosine VIIA, une myosine non conventionnelle qui se dimérise. L’étude immunohistochimique de la distribution de la protéine dans l’œil et l’oreille nous a permis de conclure que ce syndrome a pour origine l’anomalie des cellules sensorielles, dans la rétine comme dans l'oreille interne. Dans le but d'identifier les compartiments subcellulaires auxquels cette protéine motrice s'attache, une recherche de ses ligands moléculaires a été entreprise. Cinq ligands ont été isolés en utilisant la technique de double-hybride dans la levure. Un seul correspond à une protéine connue. Le second ligand identifié est une nouvelle protéine membranaire, dénommée vézatine, qui interagit avec le domaine FERM C-terminal de la myosine VIIA. La vézatine est présente aux jonctions serrées et d’adhérence des épithéliums. Par son interaction avec la vézatine, la myosine VIIA exercerait une tension entre les régions correspondantes de la membrane plasmique et le cytosquelette d’actine. Compte tenu de son profil d’expression dans les épithéliums sensoriels de l’oreille, la vézatine pourrait contribuer à la cohésion de la touffe des stéréocils et à la stabilité des jonctions intercellulaires. En nous appuyant sur ces résultats, nous avons identifié par une approche de gène-candidat, un gène codant une autre protéine, l’harmonine, comme responsable du syndrome de Usher de type IC (USH1C). Afin de disséquer finement le rôle de la myosine VIIA et de ses ligands in vivo, nous nous sommes engagés dans l’étude de l’oreille interne chez le poisson-zèbre. Le poisson-zèbre est un modèle animal de choix pour étudier cet organe sensoriel. En effet, ce poisson reste transparent tout au long de son développement et est ainsi accessible à l’observation directe. Nous avons montré que cinq allèles d’un même groupe de mutants isolés dans le laboratoire de Christiane Nüsslein-Volhard (Tübingen), les mutants mariner, sont défectueux pour la myosine VIIA. Chez ces mutants, il existe également des anomalies des stéréocils dans l’oreille interne, ce qui démontre le rôle de la myosine VIIA dans l’organisation de ces microvillosités en une touffe rigoureusement agencée dès l’émergence évolutive de cet organe sensoriel.

Mots-clés
Organes sensoriels
Physiologie sensorielle
Surdités
Développement
Biologie cellulaire

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Courmarcel Fabienne       Institut Pasteur (50%)
Laganier Sylvie           Institut Pasteur

Chercheurs de l'unité

Cohen-Salmon Martine       CR2 CNRS
El-Amraoui Aziz            Assistant de Recherche, Institut Pasteur
Hardelin Jean-Pierre       CR1 INSERM
Herbomel Philippe          CR1 CNRS
Leibovici Michel           CR2 CNRS
Levilliers Jacqueline      CR1 INSERM
Safieddine Saaid           CR1 CNRS
Soussi-Yanicostas Nadia    CR1 CNRS
Verpy Elisabeth            Assistante de Recherche, Institut Pasteur
Weil Dominique             CR1 INSERM

Stagiaires de l'unité

Ardouin Olivier           Post-doc
Boëda Batiste             Etudiant en thèse
Denoyelle Françoise       Post-doc, Praticien Hospitalier ORL (40%)
Dodé Catherine            Maître de conférence, Univ Paris V (20%)
Ernest Sylvain            Post-doc
Grati M'hamed             Etudiant en thèse
Lorin Clarisse            Etudiante en maîtrise
Marlin Sandrine           Post-doc, Pédiatre ORL
Mustapha Mirna            Post-doc
Yasunaga Shin’ichiro      Post-doc
Zwaenepoel Ingrid         Etudiante en thèse

Autre personnel de l'unité

Blanchard Stéphane              Institut Pasteur
Chardenoux Sébastien            Institut Pasteur
Kauffmann Isabelle              CNRS
Nouaille Sylvie                 Institut Pasteur

Publications de l'unité

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