Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Génétique et Biochimie du Développement pour l'année 1999

CNRS URA 1960 ROUGEON François


Responsable : ROUGEON François (frougeon@pasteur.fr )

Résumé du rapport

Les travaux de notre laboratoire sont centrés autour de deux axes principaux : (i) l'analyse des mécanismes moléculaires conduisant à l'expression clonale des immunoglobulines dans les lymphocytes B ; (ii) l'analyse des mécanismes qui contrôlent au niveau transcriptionnel et post-traductionnel l'expression de la rénine et de polypeptides propres à la glande sous-maxillaire des rongeurs.

Abstract

Work in our laboratory is centered around two main themes : (i) molecular mechanisms underlying the clonal expression of immunoglobulin genes in B lymphocytes ; (ii) transcriptional and post-transcriptional regulation of the expression of renin and other rodent submaxillary gland-specific polypeptides.

Texte du rapport

  1. Régulation de la recombinaison V(D)J des gènes des immunoglobulines (Michele Goodhardt)

L'expression des gènes codant pour les immunoglobulines (Ig) et le récepteur des cellules T nécessite l'assemblage préalable de l'exon variable, à partir de segments géniques distincts, V, D et J. Ces événements de recombinaison site-spécifique, qui ont lieu dans les précurseurs des lymphocytes B et T, sont régulés au cours du développement des cellules lymphocytaires et sont spécifiques de la lignée B ou T.

Afin d'identifier les éléments impliqués dans la régulation du réarrangement des gènes des Ig, nous avons construit des souris transgéniques portant différentes constructions de gènes de chaîne légère k non réarrangés. Ces expériences ont mis en évidence deux types d’éléments intervenant dans la régulation du réarrangement des gènes k : d’une part, des séquences activatrices associées à l’enhancer intronique, qui induisent la recombinaison et d’autre part, des séquences de type silencer localisées dans la région intersegmentaire Vk-Jk qui confèrent la spécificité du réarrangement en restreignant la recombinaison aux précurseurs B. Nous avons également étudié la structure chromatinienne des segments V et J des gènes de chaînes lourdes et légères, dans des précurseurs pro B et pre B de souris RAG2 -/- déficientes en recombinaison V(D)J. Nos résultats indiquent que des modifications de la structure chromatinienne des gènes des Ig précèdent la recombinaison V(D)J au cours de la différentiation des cellules B. L’initiation des réarrangements est associée à un remodelage de la chromatine des segments V et J, tandis que l’arrêt des réarrangements implique uniquement des changements de structure chromatinienne des segments V.

2. Expression de la terminale transférase au cours du développement (Noëlle Doyen)

La terminale déoxynucléotidyl transférase (TdT) est une enzyme impliquée dans la génération de la diversité des immunoglobulines et des récepteurs T, puisqu'elle est responsable de l'addition de nucléotides aléatoires, dits N, aux jonctions formées au cours de la recombinaison entre les segments géniques V, D et J. Absente au cours de la vie foetale, la TdT n'est exprimée que quelques jours après la naissance.

Nos travaux sont centrés autour de deux axes : l’étude des mécanismes responsables de l’expression différentielle de la TdT dans les lymphocytes T et B au cours du développement. Nous avons entrepris de caractériser les régions régulatrices et les facteurs de l’environnement impliqués dans le contrôle transcriptionnel du gène de la TdT. De plus, en étudiant la réponse immune à différentes stimulations antigéniques dans un modèle de souris transgénique exprimant la TdT, dès le stade fœtal, nous cherchons à préciser le rôle de la régulation temporelle de la diversité N dans le système immunitaire.

3. Analyse in vitro des protéines partenaires de la recombinaison V(D)J (Catherine Papanicolaou)

Nous avons développé une nouvelle méthode de production de protéines hétérologues chez E.coli (DB/MD-99/112) qui nous a permis d'obtenir en large quantité les deux isoformes de TdT murine, une forme de TdT délétée du premier tiers N-terminal et néanmoins active (TdTD129) ainsi que les protéines RAG1 et RAG2 non tronquées: (i) nous comparons les propriétés catalytiques des deux TdT murine; (ii) nous avons construit et analysons une série de variants de la TdT, afin d'identifier les résidus essentiels pour l'activité catalytique, ainsi que ceux impliqués dans la sélectivité de la TdT pour ses substrats ADN simple brin et nucléotides ; (iii) en collaboration avec Marc Delarue (unité d'Immunologie Structurale), nous avons cristallisé la TdTD129. Ces cristaux sont actuellement en cours d'analyse; (iv) nous développons un système de recombinaison acellulaire avec les protéines RAG1 et RAG2 entières.

4. Caractérisation d'un nouveau médiateur peptidique (SMR1-pentapeptide) potentiellement impliqué dans la régulation du métabolisme minéral (C. Rougeot)

Un ARNm majoritaire de la glande sous-maxillaire (GSM) du rat mâle adulte, codant pour une protéine nommée SMR1 (Submandibular Rat 1) a été caractérisé. Dans une démarche post-génomique, nous avons montré que la protéine SMR1 a les caractéristiques structurales et fonctionnelles d'un précurseur hormonal. Sa maturation conduit in vivo à la libération d'un peptide nommé SMR1-pentapeptide (SMR1-QHNPR). La sécrétion locale et systémique de ce peptide est sujette à une régulation différentielle dépendant de l'organe (GSM, prostate), du taux circulant des hormones gonadiques (androgènes) et des conditions de stimulation par le système nerveux sympathique (adrénaline). In vivo, le SMR1-QHNPR se lie, au travers de sites récepteurs spécifiques à certaines cellules spécialisées du rein, de l'os et de la dent. L'ensemble de ces données suggère que le SMR1-QHNPR est impliqué dans la modulation de l'homéostasie hydrominérale, dans certaines situations de stress.

5. Régulation et évolution du gène codant le précurseur SMR1 (I. Rosinski-Chupin)

Dans la GSM du rat, l'expression du gène codant SMR1 est très fortement induite par les androgènes. En utilisant ce modèle, nous cherchons à comprendre comment des variations physiologiques de l'ordre de 10 fois en taux circulants d'inducteurs (androgènes) peuvent conduire à une augmentation de 200 à 1000 fois des niveaux d'expression génique. Grâce à une démarche principalement basée sur l'hybridation in situ, nous avons montré qu'en conditions physiologiques de faibles concentrations en androgènes, l'expression de SMR1 est hétérocellulaire, au sein de la population de cellules acineuses de la GSM. Les androgènes induisent à la fois une augmentation du nombre de cellules exprimant SMR1 et une augmentation de la quantité d'ARNm par cellule. Nous cherchons maintenant à préciser les mécanismes mis en jeu dans la régulation transcriptionnelle de l'expression du gène SMR1.

Par ailleurs, le gène codant SMR1 appartient à une famille multigénique qui a été caractérisée en partie chez la souris et le rat. Nos efforts portent actuellement sur la caractérisation des gènes de cette famille chez l'homme. Nous cherchons par ailleurs à préciser les événements qui ont abouti à la diversification des gènes de cette famille au cours de l'évolution.

6. Immortalisation des cellules épithéliales de la glande sous-maxillaire (Brid Lefévère-Laoide)

Nous avons établi et caractérisé deux lignées de cellules, à partir de GSM de souris transgéniques pour l'antigène T de SV40 : lignée SIMS (en collaboration avec Mme. O. Kellermann et M. C. Babinet, Institut Pasteur) soit pour l'antigène T du polyome : lignée SIMP (PyLT : M. F. Cuzin, Nice) et nous sommes parvenus à recréer, in vitro, les structures présentes, in vivo, dans la glande sous-maxillaire. Les deux lignées cellulaires épithéliales que nous avons établies représentent donc un modèle cellulaire de choix pour l'étude des mécanismes impliqués dans l'expression tissu-spécifique et hormono-dépendante de la rénine sous-maxillaire chez la souris.

Mots clefs :

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

BOUTOUT Laurence, IP, lboutout@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

ROSINSKI-CHUPIN Isabelle, IP, Email : ichupin@pasteur.fr DOYEN Noëlle, IP, E-mail : ndoyen@pasteur.fr GOODHARDT Michèle, CNRS, E-mail : migood@pasteur.fr LEFEVERE-LAOIDE Brid, IP, E-mail : blaoide@pasteur.fr PAPANICOLAOU Catherine, CNRS, E-mail : papanico@pasteur.fr ROUGEOT Catherine, IP, E-mail : crougeot@pasteur.fr

Stagiaires de l'unité

BOULE Jean-Baptiste, Thèse, E-mail : jboule@pasteur.fr COQUILLEAU Isabelle, Thèse, E-mail : icoq@pasteur.fr HUAULME Jean-François, Thèse, E-mail : jhuaulme@pasteur.fr MAES Jérôme, Thèse, E-mail : jmaes@pasteur.fr NOURRIT Françoise, Thèse, E-mail : fnourrit@pasteur.fr

Autre personnel de l'unité

CAVELIER Patricia, CNRS, E-mail : cavelier@pasteur.fr HERMITTE Véronique, IP, E-mail : hermitte@pasteur.fr KLIMCZAK Martine, IP, E-mail : mfanton@pasteur.fr

Publications de l'unité

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