Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Entérobactéries pour l'année 1999

INSERM 389


Responsable : GRIMONT Patrick (pgrimont@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L'Unité comprend des laboratoires de recherche, deux Centres Nationaux de Référence, et deux laboratoires en rapport avec l'industrie. Tous les aspects de la taxonomie bactérienne sont développés en ayant pour objectif d’apporter une meilleure définition moléculaire et physiologique des espèces et de réaliser des outils nouveaux de typage épidémiologique. Si historiquement, le groupe bactérien étudié était les entérobactéries, nos méthodes ont été appliquées à d'autres groupes, y compris des pathogènes émergeants.

Abstract

The Unit includes research laboratories, two National Reference Centers, and two industry-oriented laboratories. All modern aspects of bacterial taxonomy are considered with the purposes of providing a molecular and physiological definition of bacterial species and designing new typing tools for epidemiological studies. Although the Unit was historically concerned with the Enterobacteriaceae, our methods have been applied to other bacterial groups including emerging pathogens.

Texte du rapport

Taxonomie moléculaire bactérienne (Patrick Grimont)

La plupart des méthodes moléculaires sont d'application universelle. L'hybridation ADN-ADN est maintenant l'outil essentiel pour délimiter les espèces bactériennes. Une fois ces espèces délimitées avec soin, il est possible de rechercher des caractères phénotypiques (galerie Biotype-100) ou des zones spécifiques dans la séquence de l'ARN 16S. Plusieurs nouvelles espèces potentielles sont en cours d'étude.

Phylogénie bactérienne (Catherine Dauga)

L’analyse phylogénétique de la comparaison des séquences primaires des gènes conduit à la construction d’un arbre phylogénétique. Cet arbre phylogénétique met en évidence les groupes de souches formés par la descendance d’un ancêtre commun. Nous étudions dans quelle mesure ces groupes monophylétiques correspondent aux espèces, aux genres et aux familles bactériennes. La séquence de gènes différents a été étudiée.

Typage moléculaire et détection de facteurs de virulence (Francine Grimont)

Des systèmes de typage moléculaire basés sur les méthodes les plus performantes comme la ribotypie (née dans notre Unité) sont développés. L’identification automatique des profils grâce à un logiciel (Taxotron) a été mise au point. Des bases de données pour l'identification automatique des ribotypes ont été créées pour Escherichia coli, Shigella, Salmonella enterica sérotype Typhi, Pseudomonas, Vibrio cholerae, et Corynebacterium diphtheriae. Une approche de “sérotypie génétique” est en cours de développement : ce sont les profils de restriction après amplification de la région “O” et après amplification du gène codant la flagelline dans le but de déterminer le sérotype complet des Escherichia coli et Shigella sans l’aide de sérums. Grâce à cette méthode, un nouveau sérotype de Shigella dysenteriae a été mis en évidence. Des systèmes PCR pour l’identification des pathotypes de E. coli sont en cours de mise au point.

Immuno-taxonomie bactérienne (Philippe Bouvet)

L’immuno-diagnostic bactériologique (préparation de sérums pour sérotypage ou d’antigènes pour sérodiagnostic d’infections) repose encore souvent sur l’utilisation de bactéries entières avec de nombreux problèmes de réactions croisées. Nous réétudions l’immunologie de bactéries importantes en microbiologie clinique, alimentaire ou vétérinaire à l’aide d’antigènes purifiés et des techniques immunologiques les plus récentes. Les retombées sont recherchées en identification et en diagnostic sérologique. Un sérodiagnostic détectant les anticorps dirigés contre 25 sérogroupes O de Escherichia coli choisis pour leur association avec la production de Shiga-toxine, a été mis au point.

Biodiversité métabolique des bactéries (Odile Bouvet)

L’évolution fonctionnelle développée par les bactéries au cours de leur adaptation à leur hôte (l’Homme, les animaux) ou à l’environnement est recherchée. La connaissance des caractéristiques métaboliques propres à chaque espèce contribue à une meilleure compréhension des mécanismes de survie des bactéries dans des biotopes très divers et permet des applications diagnostiques et biotechnologiques. Les capacités métaboliques des bactéries liées à la synthèse d’un biopolymère, le poly-b-hydroxyalcanoates (PHA), sont étudiées. L’émergence de nouveaux biomatériaux constitue en effet un enjeu pour le développement de nouvelles formes pharmaceutiques et de nouvelles thérapies reconstructives. Nous participons, pour les aspects physiologiques, aux travaux developpés dans l’Unité concernant la viabilité des bactéries. Le comportement physiologique (état énergétique et oxydatif des cellules, capacité métabolique : transport des nutriments, pools intracellulaires et activité des voies métaboliques majeures) des espèces soumises à différentes conditions de stress est étudié. Pour effectuer ce type de recherche, nous développons de nouvelles méthodologies pour une approche globale du métabolisme.

Aquabiolab (Patrick Grimont et Béatrice Regnault)

Ce laboratoire, soutenu par Vivendi Water, met au point des méthodes moléculaires pour la surveillance bactériologique des eaux. La connaissance des séquences d'ARN 16S nous permet de réaliser des sondes oligonucléotidiques fluorescentes pour visualiser, par hybridation in situ, les bactéries possedant les séquences-cibles complémentaires dans leurs ribosomes. Un travail fondamental sur la frontière entre la vie et la mort des bactéries a été entrepris. Des tests sont mis au point pour la distinction en hybridation in situ des bactéries vivantes, mortes, et viables mais non cultivables.

Centre National de Référence des Salmonella et Shigella (Patrick Grimont et Philippe Bouvet)

Chaque année, le Centre sérotype complètement (avec 164 sérums) plus de 10 000 souches de Salmonella provenant d’environ 1600 laboratoires d’analyses de biologie médicale. Il sérotype aussi près d’un millier de Shigella et identifie biochimiquement près de 500 souches d’autres entérobactéries. Le Centre alerte la Direction Générale de la Santé, l’Institut de Veille Sanitaire lorsqu’il détecte des cas groupés, des épidémies ou l’augmentation de fréquence d’un sérotype. Pour ce faire, un système original informatisé de surveillance et d’alerte des salmonelloses humaines a été mis au point au Centre qui permet de documenter les tendances spatiales et temporelles des sérotypes sous surveillance et de détecter précocement au niveau national, régional ou départemental sur une base hebdomadaire ou mensuelle toute augmentation anormale du nombre d’isolements de Salmonella et de Shigella. Le Centre participe au réseau européen de surveillance Enter-Net.

Centre National de Référence pour le Typage Moléculaire Entérique (Patrick Grimont et Francine Grimont)

Ce Centre effectue la ribotypie de toute bactérie à la demande des autorités sanitaires ou hospitalières. L’acquisition en 1999 avec la CIP d’un RiboPrinter nous permet de ribotyper toutes les souches de Salmonella sérotype Typhi ainsi que diverses bactéries responsables d’infections nosocomiales. La détection des facteurs de virulence de E. coli est effectuée sur demande. Le Centre effectue aussi la lysotypie de Salmonella sérotypes Typhi, Typhimurium, Paratyphi A, Paratyphi B, Enteritidis, et Dublin, et le sérotypage des Serratia. Le Centre a étudié 2206 souches par ribotypie et/ou lysotypie, 213 souches/prélèvements par PCR (détection de gènes de pathogénicité), et confirmé ou reconnu 262 souches de Shigella/ou nouveau sérotype. Le CNRTME participe dans Enter-Net au réseau européen de surveillance pour les souches Salmonella enterica sérotypes Typhi, Typhimurium, Enteritidis, Dublin, et les Escherichia coli entérohémorragiques.

Taxolab (Patrick Grimont et Martine Lefèvre)

Ce laboratoire effectue la caractérisation des bactéries industrielles par des méthodes moléculaires (séquençage de l'ARN 16S, hybridation des ADN, ribotypie complète avec 10 endonucléases de restriction, détection de gènes de virulence, détermination du nombre de copies d'un plasmide, détection et caractérisation de bactériophages), effectue des recherches bibliographiques et offre des conseils techniques.

Taxolab software (Patrick Grimont)

Mise au point et amélioration de l'ensemble logiciel Taxotron comprenant les programmes Recognizer (identification bactérienne utilisant la galerie Biotype-100, BioMérieux), RestrictoScan (capture des distances de migration des fragments de restriction), RestrictoTyper (interpolation de la taille des fragments de restriction, construction de bases de données de tailles de fragments, identification automatique), Adanson (taxonomie numérique), Dendrograf (arbres, dendrogrammes), Antibiotyper (saisie de données quantitatives, distance euclidienne), et FactorAna (analyses factorielles). Ce logiciel est adapté au PowerMacintosh.

MOTS-CLES

Taxonomie, Typage moléculaire, Phylogénie, Ribotypie, Biodiversité

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

SYLVAIN Chantal
LEBRI Zoulika
PERANCE Marie-Valérie

Chercheurs de l'unité

BOUVET Odile, INSERM
BOUVET Philippe, IP
DAUGA Catherine, IP
GRIMONT Francine, INSERM
GRIMONT Patrick, IP

Stagiaires de l'unité

BURGUIERE Pierre, stage
COELHO Corentin, stage
COIMBRA Roney Santos, thèse
DIARD Stéphane, thèse
DOMINGO Marc-Christian, stage
GIAMMANCO Giovanni, contrat
GIAMMANCO Giuseppe, stage
GRANIER Christelle, stage
GUERIN Catherine, stage
KOZODEROVIC Gordana, stage
LAILLER Renaud, stage
LALANDE Françoise, stage
LEE Eune-Sub, stage
MOKROUSOV Igor , stage
PIGNATO Sarina, stage
PLIN Catherine, stage
POURSHAFIE Mohammed, stage
RETY Céline, stage
SALINAS Julien, stage
SCHLEGEL Laurent, thèse
SERBAN Antoinette, stage
VILLARINO Andrea, thèse

Autre personnel de l'unité

JANVIER Monique, Ingénieur IP
AGERON-ARDILA Elisabeth, INSERM
CARLE Isabelle, IP
GUESNIER Françoise, IP
GUIBERT Véronique, IP
ISSENHUTH-JEANJEAN Sylvie, IP
KLEIN Brigitte, CNRS
K'OUAS Guylène, IP
LEFEVRE Martine, IP
LEJAY-COLLIN Monique, IP
LENORMAND Pascal, IP
MARTIN-DELAUTRE Sylvie, IP
METZ Laurence, IP
REGNAULT Béatrice, IP
RUCKLY Corinne, IP

Autre personnel

PRETESAC Annie
LEGER Patrick
LELEU Simone
ROUX Chrystelle
GOULETTE Nicolas

Publications de l'unité

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