Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Embryologie moléculaire pour l'année 1999

CNRS URA 1947


Responsable : BRULET Philippe (pbrulet@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Nos recherches sont centrées sur l'étude du développement du système nerveux de l'embryon chez la Souris et sur son fonctionnement. On s'attache plus précisément à définir les mécanismes moléculaires sous-jacents à l'information de position pendant l'embryogenèse, aux régulations génétiques lors de la mise en place de la tête et de régions céphaliques. Pour établir le rôle d'un gène dans son contexte physiologique, nous avons développé, il y a plus de dix ans, une mutagenèse spécifique permettant de remplacer in vivo un gène par un autre, appelé depuis le "knock-in". De nouveaux outils génétiques sont développés pour cartographier des circuits neuronaux pendant leur mise en place, leur maturation ou pendant un apprentissage. Cette approche nécessite la construction de protéines diffusant à travers les synapses dans le système nerveux. L'imagerie est réalisée par microscopie confocale à multiphotons. Des recherches sont entreprises en imagerie fonctionnelle par résonance magnétique nucléaire. De nouveaux agents de contraste paramagnétiques sont à l'étude permettant le déclenchement du paramagnétisme par régulation génétique. De nouveaux gènes rapporteurs sont aussi développés pour imager l'activité calcique dans les synapses in vivo.

Abstract

Our research is centered on the analysis of the nervous system development and function in mouse embryos. A genetic technique, the knock-in, relying on homologous recombination in embryonic stem cells was developed to replace one gene by another in order to analyse cellular and molecular mechanisms in vivo. This specific mutagenesis allows a better analysis of a gene role in its natural physiological context during a biological process. Special emphasis is given to the molecular nature of positional information in the embryo and on the genetic regulatory mechanisms underlying brain formation. New techniques are being developed to map neuronal circuits during their establishment in embryogenesis, during their refinement and during a learning paradigm. They rely on the construction of hybrid proteins that migrate transynaptically into the central nervous system for multiphoton confocal microscopy detection. For functional magnetic resonance studies, new paramagnetic contrasts agents are being designed and studied. At the same time, we are constructing new reporter genes sensitive to calcium fluxes to image synaptic activities in vivo.

Texte du rapport

Information de position et identité cellulaire le long de l'axe rostro-caudal (H. Le Mouellic).

L'inactivation de l'homéogène Hoxc-8 entraîne des transformations homéotiques dans les dérivés mésodermiques chez la Souris. Cette mutation affecte aussi les cellules nerveuses de la moelle. En particulier la mutation nulle Hoxc-8 entraîne l'apoptose des MNs dans certains segments au moment de la synaptogenèse ainsi qu'une réorganisation des cartes somatotopiques de la moelle. La nature moléculaire et cellulaire de l'information de position le long de l'axe antéro-postérieur est recherchée. D'autre part, la question de l'établissement des coordonnées spatiales au moment de la gastrulation est abordée. Pour rechercher les gènes activateurs des gènes Hox une approche par mutagenèse exhaustive, en utilisant un nouveau type de rétrovirus, a été entreprise dans les cellules ES.

Le contrôle génétique du développement des régions céphaliques (Y. Lallemand).

Pour chacun des homéogènes Otx1 et Otx2, substitué par le LacZ, des lignées de souris mutantes ont été obtenues. La gastrulation des embryons homozygotes Otx2-/- est fortement perturbée, entraînant leur létalité. Ainsi l'induction du neuroectoderme antérieur ne peut se réaliser. Les segments qui devraient former le pro-encéphale et le mésencéphale sont éliminés par la mutation. Nous avons, grâce à la technique du SAGE, comparé le transcriptome des embryons sauvages au tout début de la gastrulation à E6.5 avec celui des embryons mutants Otx2-/-. Deux cents gènes activés réprimés ou modulés fortement par Otx2 à ce stade embryonnaire ont été identifiés. Trois gènes dont l'expression est directement contrôlée par Otx2 sont plus particulièrement étudiés. La mutation nulle Otx1, par contre, influence la neurogenèse tardive. Le développement du néo-cortex est affecté. Cette structure qui évolue le plus rapidement chez les mammifères est donc modifiée par la mutation de l'homéogène Otx1. Ces souris Otx1-/- sont des animaux modèles pour l'épilepsie.

Cartographie génétique des circuits neuronaux (U. Maskos, S. Roux, K. Kissa).

Une nouvelle technique génétique est développée pour cartographier un circuit neuronal avec une résolution de l'ordre de la synapse soit lors de sa mise en place et de ses raffinements successifs, soit pendant un apprentissage.Une telle approche nous permet aussi d'évaluer l'impact d'une mutation sur la structure et le fonctionnement d'un circuit. C'est une première étape pour analyser génétiquement des comportements simples chez un animal. Notre approche repose sur la construction de protéines traceurs qui puissent migrer à travers des synapses dans le système nerveux. Une première génération de molécules contenant divers fragments de la toxine du tétanos fusionnés à la GFP ont été particulièrement étudiées. Des animaux transgéniques contenant de tels gènes et dont l'expression est contrôlée par des promoteurs spécifiques pour des populations de neurones sont analysés. L'imagerie est réalisée par microscopie confocale à multiphotons. L'imagerie par résonance magnétique nucléaire permet désormais la détection de l'activité génétique dans les tissus internes de l'animal vivant. Des résolutions de l'ordre de la cellule commencent à être obtenues. Nous cherchons à développer des agents de contraste pour visualiser chez l'animal vivant des circuits neuronaux actifs. Cette technique permettra de mieux analyser les rôles des gènes Otx1, Otx2, Hoxc-8, NMDA, dans la mise en place des synapses et dans leur fonctionnement.

Analyse mutationnelle de l'activité synaptique dans les circuits neuronaux (V. Baubet, H. Le Mouellic).

L'activité électrique des cellules nerveuses est impliquée lors de la mise en place des connexions nerveuses pendant la synaptogenèse, pendant le raffinement de ces connexions et naturellement pendant le fonctionnement normal des réseaux neuronaux. L'imagerie des flux calciques dans les cellules nerveuses permettrait de mettre en évidence des circuits neuronaux fonctionnels. Notre approche consiste à développer de nouveaux marqueurs génétiques, sensibles aux variations de concentration du calcium et qui pourraient être ciblés spécifiquement dans des loci génétiques intéressants. Par analogie avec la bioluminescence déclenchée par les flux calciques chez la méduse, des protéines de fusion entre l'aequorine et la GFP ont été construites. L'accrochage du calcium à la protéine hybride entraîne une émission de lumière verte par la GFP, par "Chemiluminescence Energy Transfer" ou CRET. Une étude pour corréler la concentration calcique détectée dans la cellule par patch-clamp, avec l'intensité de la lumière émise a été initiée. Un avantage de cette technique est que les concentrations locales intracellulaires peuvent être imagées grâce à des signaux de localisation. Une protéines hybride synaptotagmine aequorine GFP a été obtenue pour analyser plus particulièrement le fonctionnement de la synapse dans des animaux transgéniques.

Isolement de cellules souches à partir de cellules somatiques de Souris (S. Picaud).

C'est un nouveau projet avec deux objectifs. Premièrement l'introduction de mutations ciblées dans le CNS d'organismes autres que la Souris et plus proches de l'Homme et d'autre part la production et modification génétique in vitro de cellules souches neuronales à des fins de recherche fondamentale et thérapeutique. Le transfert de noyau de cellules ES recombinantes à un oocyte de souris est entrepris.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

COMPAIN Marinette : mcompain@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

BRULET Philippe, CNRS/IP : pbrulet@pasteur.fr

LALLEMAND Yvan, IP : yvanlal@pasteur.fr

LE MOUELLIC Hervé, INSERM : hervelm@pasteur.fr

MASKOS Uwe, IP : umaskos@pasteur.fr

Stagiaires de l'unité

BAUBET Valérie, Post-doc
HASHEMI Reza, Stagiaire
KISSA Karima, Thèse
ROUX Sylvie, Post-doc

Autre personnel de l'unité

PICAUD, Sandrine, CNRS : Assistant Ingénieur.

RUSSE Sophie, IP : Aide de Laboratoire.

SAINT CLOMENT Cécile, IP : Technicienne sup.lab.

Publications de l'unité

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