Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Bactéries et Champignons entomopathogènes pour l'année 1999


Responsable : PAPIEROK Bernard (papierok@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Bacillus thuringiensis et B. sphaericus sont les deux bactéries prioritairement étudiées au laboratoire, avec comme insectes-cibles les larves de moustiques. Les recherches ont pour objet, d’une part l’analyse des interactions insecte/toxine, avec l’étude du mode d’action des toxines et des mécanismes conduisant au développement de résistances et d’autre part, la caractérisation des toxines issues des bactéries et celle de leurs gènes, avec pour objectif majeur la diversification du potentiel de ces microorganismes. À ces thématiques sont étroitement associées les missions du Centre Collaborateur de l’OMS hébergé par le laboratoire. En matière de champignons s’attaquant aux insectes, les travaux ont porté principalement sur la caractérisation d’espèces d’Entomophthorales inféodées à des Homoptères ou à des Diptères.

Abstract

Research on bacteria focused on Bacillus thuringiensis and B. sphaericus, with mosquito larvae as target insects. Studies were carried out along two basically complementary axes: 1) analysis of insect toxin interactions, including study of toxin mode of action and study of mechanisms which led to the development of resistance, and 2) characterization of toxins from entomopathogenic bacteria and study of their genes, with the view of enhancing potential of these microorganisms. Moreover, as WHO Collaborating Centre for entomopathogenic bacteria, the laboratory carried on identifying and characterizing Bacillus strains. Investigations on insect-killing fungi were devoted mostly to the characterization of entomophthoralean species pathogenic for Homoptera or Diptera.

Texte du rapport

Mode d'action des toxines de Bacillus sphaericus sur les larves de moustiques (Jean-François Charles)

Chez les larves de Culex pipiens, un récepteur spécifique de la toxine binaire de Bacillus sphaericus est présent sur les membranes intestinales. Ce récepteur a été identifié, il s’agit d’une a-glucosidase de 60kDa, appartenant à la famille des maltases. Le clonage, l’expression et la fonctionnalité de cette enzyme en tant que récepteur viennent d’être effectués, en collaboration avec une équipe de l’INRA d’Antibes.

Clonage du gène codant le récepteur potentiel à la toxine de B. sphaericus chez Anopheles gambiae (Isabelle Thiéry)

Sur la base des résultats acquis concernant le récepteur à la toxine binaire de B. sphaericus chez Culex pipiens, l’étude du récepteur potentiel chez Anopheles gambiae, également sensible à la bactérie, a été entreprise. Le gène identifié chez C. pipiens est utilisé comme sonde. Les expériences de Northern blot, après extraction des ARN spécifiques des tubes digestifs des larves et des adultes, sont en cours (en collaboration avec Catherine Bourgouin, Unité d’Écologie des Systèmes Vectoriels).

Structure et fonction de la toxine binaire de B. sphaericus (Christina Nielsen-LeRoux, Jean-François Charles)

Chez B. sphaericus le facteur majeur de toxicité est une toxine binaire (complexe BinA et BinB). Une toxine Bin, mutante naturelle, non toxique ayant été identifiée, les raisons de l’absence d'activité larvicide ont été recherchées. La non toxicité n'est pas due à une absence de liaison au récepteur. Comme donc la partie BinB reste fonctionnelle, il semble en fait que ce soit une mutation sur le composant BinA qui soit responsable de l'absence de toxicité à l’égard des larves de Culex pipiens.

Mécanismes de la résistance des larves de Culex pipiens à Bacillus sphaericus et gestion du phénomène sur le terrain (Christina Nielsen-LeRoux)

L’élargissement des recherches à des populations d’origine géographique variée révèle que le mécanisme à l’origine de la résistance le plus fréquent est une modification de l’étape de liaison toxine-récepteur. D’autres mécanismes peuvent intervenir, notamment pour des populations du bassin méditerranéen. Par ailleurs, l’étude approfondie de deux souches de B. sphaericus toxiques à l’égard de larves résistantes aux souches utilisées a été entreprise dans plusieurs directions complémentaires. Leur activité n’est pas due à la toxine binaire mais à d’autres facteurs, qui sont présentement analysés. Il a été en outre montré, en collaboration avec des équipes brésilienne et chinoise, que l’une de ces deux souches retarde l’apparition de la résistance comparativement aux souches commercialisées. Son intérêt dans la pratique est étudié.

Caractérisation de souches bactériennes actives sur les larves de moustiques (Armelle Delécluse)

La recherche de nouvelles toxines produites par la souche Bacillus thuringiensis medellin a été poursuivie. Deux protéines, désignées Cry29A et Cry30A et présentant des similitudes limitées avec les autres d-endotoxines de B. thuringiensis, ont été caractérisées. Aucune activité biologique de ces protéines n’a pu être mise en évidence sur les espèces de moustiques Aedes aegypti, Culex pipiens et Anopheles stephensi ; une activité sur d’autres espèces de moustiques n’est pas exclue.

L’étude de la régulation des gènes codant les toxines Cry11B et Cry19A de B. t. jegathesan a été entreprise. Le gène cry11B est exprimé spécifiquement pendant la sporulation précoce, à partir du facteur sE ; l’expression du gène cry19A s’effectue dès la phase transitoire de croissance et se poursuit pendant la phase de sporulation tardive, impliquant respectivement les facteurs sH et sK.

Résistance des larves de moustiques aux nouvelles toxines (Armelle Delécluse)

L’activité des toxines Cry11B et Cry19A a été évaluée sur différentes populations de moustiques résistant aux toxines de B. t. israelensis ou B. sphaericus. Chacune de ces toxines permet de diminuer le taux de résistance de façon significative : de 10 à 100 fois selon les populations. Ces deux protéines sont donc de bons candidats pour une future utilisation, en particulier pour la construction d’organismes recombinants.

Amélioration du pouvoir pathogène de Bacillus sphaericus (Armelle Delécluse, Victor Juárez-Pérez)

Des séquences promotrices de B. sphaericus, permettant une bonne expression de gènes de toxines hétérologues chez cet hôte pendant la phase de sporulation, ont été recherchées. Dix séquences répondant à ces critères ont été identifiées et sont en cours d’analyse.

Détection de la ß-exotoxine dans les cultures de Bacillus thuringiensis (Isabelle Thiéry)

Certaines souches de B. thuringiensis produisent un nucléotide analogue de l’ATP, tératogène et non spécifique, la ß-exotoxine thermostable. Cet haptène était détecté dans les surnageants de cultures au moyen d’un test biologique utilisant les larves néonates de la teigne de la farine. L’application de la méthode ELISA n’a pas permis une détection ainsi qu’une reproductibilité des résultats satisfaisantes. Il a été montré, en revanche, que l’analyse par chromatographie liquide haute pression permet une détection fiable du type I- de la ß-exotoxine. L’application aux souches types des sérotypes H22 à H69 de B. thuringiensis a révélé qu’aucune d’entre elles ne produit ce métabolite (collaboration avec Juan Ferré, Université de Valence, Espagne).

Évaluation de Bacillus thuringiensis israelensis dans la lutte contre le moustique Aedes aegypti (Isabelle Thiéry, Bernard Papierok)

Il s’agit, dans le cadre d’une action concertée du Réseau International des Instituts Pasteur et Instituts Associés, d’évaluer sur des bases standardisées l’efficacité de la variété israelensis dans la luttre contre le vecteur majeur des virus de la dengue qu’est Aedes aegypti. Après l’instauration, dans un premier temps, de l’utilisation de préparations bactériennes en lutte opérationnelle à Cayenne (collaboration avec le Laboratoire d’Entomologie médicale de l’Institut Pasteur de la Guyane), l’analyse de la situation au Viet-Nam, où B. t. israelensis n’est pas encore homologué, a été entreprise. Il était en effet opportun d’étudier, avant toute application éventuelle, la diversité des Bacillus dans les gîtes larvaires du moustique. Il ressort de l’étude qui a débuté en collaboration avec l’Institut Pasteur de Ho Chi Minh Ville, que B. sphaericus et B. cereus sont majoritaires.

Systématique et écologie des champignons s’attaquant aux insectes (Bernard Papierok)

Les recherches effectuée sur le terrain en collaboration avec l’Institut Phytopathologique Benaki au cours des deux années précédentes avaient conduit à reconnaître, pour la première fois, l’aptitude de deux Entomophthorales, Entomophthora planchoniana et Erynia neoaphidis, à causer des épizooties dans les peuplements de pucerons évoluant sur différentes plantes cultivées dans le sud de la Grèce. La caractérisation moléculaire des souches grecques (taille des ITS, RAPD-PCR) de E. neoaphidis, une espèce inféodée aux pucerons, été entreprise, comparativement à des souches originaires des parties océanique et continentale de l’Europe ou d’autres continents. Des souches isolées de Diptères ont également été prises en considération.

Centre Collaborateur de l’OMS

Le laboratoire héberge le Centre Collaborateur de l’OMS en matière de bactéries sporulées entomopathogènes pour la lutte biologique contre les vecteurs de maladies. À ce titre, il a identifié en 1999, par sérotypie, sur la base des antigènes flagellaires, par utilisation de caractères biochimiques et, le cas échéant, par comparaison des profils polypeptidiques d’inclusions parasporales, près de 200 souches originaires principalement d’Europe, d’Amérique du Sud et du sous-continent indien. Plus de la moitié de ces souches se sont révélées appartenir à l’espèce thuringiensis. Un nouveau sérotype, originaire de Chine, a été reconnu ; il s’agit du 70ème séroytpe de cette bactérie. La Collection Internationale des Bacillus entomopathogènes (Collection IEBC) comportait fin 1999 6000 souches. Le laboratoire a procédé également à l’évaluation de l’activité, à l’égard des larves de plusieurs espèces de moustiques, des souches reçues pour identification et de produits adressés pour expertise.

Mots clefs

Pathogènes d’insectes, Bacillus, champignons, toxines, moustiques, résistance

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

BLANC Marie-France

Chercheurs de l'unité

CHARLES Jean-François, IP
DELÉCLUSE Armelle, IP
LAURENT Philippe, CNRS
NIELSEN-LE ROUX Christina, IP

Stagiaires de l'unité

ALAPLANTIVE Anne, IUT
CHAK Kin Fu, Professeur invité
IBARRA Jorge, Chercheur invité
JUÁREZ-PÉREZ Victor, Postdoc
ROSSO Marie-Laure, Thèse
SILVA-FILHA Maria-Helena, Thèse
STALMACHOVÁ Mariana, Thèse (étranger)
VENDRELY Charlotte, Maîtrise

Autre personnel de l'unité

THIÉRY Isabelle
BRÉMONT Sylvie
CORRE-CATELIN Nicole
COSMAO DUMANOIR Véronique
DELATRE Nelly
HAMON Sylviane
RIPOUTEAU Huguette
PATRICIO Vidalia
FILLODEAU Anne-Marie
VILEY Christine

Publications de l'unité

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