Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Biologie des Populations lymphocytaires pour l'année 1999

CNRS URA 1961


Responsable : FREITAS Antonio Fax 33-(0)1 45 68 89 21 / Tel 33 (0)1 45 68 85 82 (afreitas@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L’Unité de Biologie des Populations Lymphocytaires a comme objectifs d’: a) étudier les mécanismes d'homéostasie; b) étudier les dynamiques des populations lymphocytaires: taux de production, de survie et de mort cellulaire ainsi que les taux de renouvellement de ces populations; c) étudier le rôle de la compétition cellulaire dans la régulation du système immunitaire, la tolérance et la mémoire immunologique.

Abstract

The main objectives of the Unité de Biologie des Populations Lymphocytaires are : a) To study lymphocyte homeostasis,
b) To study the rates of lymphocyte production and renewal, and of the mechanisms of lymphocyte survival and death, c) To establish the role of lymphocyte competition in the organization and regulation of the immune system, d) To study the mechanisms of immunological memory.

Texte du rapport

Introduction:

Chez un vertébré adulte, le nombre total de lymphocytes est sous un contrôle homéostatique assez strict. Il y a cependant une production continue de nouvelles cellules dans la moelle osseuse et le thymus. A la périphérie, les stimulations antigéniques induisent la division cellulaire et par conséquent, la production de nouvelles cellules. Le nombre total de cellules étant limité, chaque lymphocyte ne peut survivre qu'après la mort d'autres cellules. La définition la plus simple du système immunitaire est de dire qu’il consiste en une cohorte de populations lymphocytaires. On devrait ajouter que toutes ces populations ont un unique but : grandir et survivre. Toutefois, la croissance et la survie de ces populations de cellules ne peuvent se réaliser que dans les contraintes imposées par un espace limité, les ressources. Par conséquent, il est probable que les populations lymphocytaires suivent les règles biologiques générales qui régulent les différentes espèces dans un système écologique : les règles de compétition, de réciprocité, d’interactions prédateur/proie, etc.

  1. Homéostasie des cellules B (Fabien Agenes & Manuela Rosado): Pourquoi le nombre de cellules B est-il celui que l'on observe? Est-il le résultat d'une production insuffisante ou inefficace de nouvelles cellules B? Est-il limité à la périphérie par une quantité insuffisante d'espace ou de "ressources"? Nous avons construit des souris chimériques reconstituées avec des mélanges de cellules précurseurs de moelle osseuse (MO) de souris normale et de souris mMT (incapable de produire des cellules B) en proportions variables. Nous avons constaté que les groupes de chimères contenant plus du tiers du nombre normal de cellules pro et pre-B présentait un nombre de cellules B périphériques identique à celui observé dans les conditions physiologiques normales. Le maintien du nombre physiologique de cellules B périphériques dépend cependant d'une production minimale et continue de nouvelles cellules (chez les chimères avec un nombre très réduit de cellules pre-B, le nombre de cellules B périphériques est diminué). Nous avons également réalisé des parabioses entre différentes lignées de souris (établissement d'une circulation croisée entre deux animaux). L'analyse des parabioses entre souris normale et mMT a confirmé que la production cellulaire d'une seule souris est suffisante pour "remplir" les organes lymphoïdes secondaires de deux souris. En doublant les "ressources" disponibles, le nombre total de lymphocytes B est doublé. A la lumière de ces expériences, nous avons conclu qu’un nombre relativement limité de précurseurs lymphopoïétiques est suffisant pour reconstituer des animaux (parabioses [B6mMT/B6Ly5] et chimères [B6mMT/B6Ly5]). Dans les souris chimères (normale+mMT), nous avons vérifié que le nombre de cellules B activées, le nombre de cellules sécrétrices d'IgM, ainsi que les taux d'IgM sériques, étaient toujours constants quelque soit le nombre de cellules pre-B ou le nombre de cellules B matures. Lorsque le nombre de cellules B matures passe au-dessous d'un certain seuil, les compartiments terminaux (cellules activées, plasmocytes) sont préférentiellement remplis. Plus le nombre de cellules pre-B diminue, plus le ratio [cellules B au repos / cellules sécrétrices] décroît. Ce résultat indique que le contrôle homéostatique des populations B activées se fait de façon autonome par rapport au contrôle homéostatique des populations B au repos. Le système immunitaire montre une organisation hiérarchique qui a comme priorité de conserver les taux d'IgM sériques qui constituent une première barrière de défense, et d'assurer un réservoir de diversité chez les populations B au repos.
  2. Sélection des cellules B activées (Fabien Agenes): Nous avons ensuite étudié le comportement des populations B périphériques en l’absence d'un compartiment de cellules précurseurs. Pour cela, nous avons reconstitué des souris déficientes en cellules B (Rag2-/-) avec des suspensions cellulaires de ganglions dans lesquelles ne sont présentes que des cellules B et T matures. Dans ces animaux, le devenir des cellules B matures suit une cinétique particulière: après une diminution initiale du nombre de cellules, on note une expansion cellulaire; le nombre de cellules atteint 15 jours après transfert, persiste ensuite pendant au moins 4 mois. Ces cellules acquièrent un phénotype "activé": leur taille est augmentée, elles expriment fortement IgM, mais moins IgD. Elles n'expriment pas CD5 ou Mac1. Le nombre de cellules sécrétrices est très élevé dans ces animaux (10% des cellules B périphériques vs. 1% chez la souris normale) et le taux d'IgM sériques est normal. Un nombre limité de 4x106 cellules B est capable de reconstituer totalement les compartiments terminaux de la lignée B (plasmocytes, Ig sériques). Ce phénomène est complètement indépendant de la présence de cellules T, puisque l'on obtient le même résultat en réalisant des transferts de cellule B d'une souris CD3 -/- dans une souris Rag2 -/-. Le transfert de nombres variables de cellules B matures (103 à 5x107) nous a permis de constater que le taux de croissance des cellules transférées est assez lent et suggère que les cellules atteignent un nombre maximal 6 mois après transfert. Une fois de plus, l'homéostasie des populations de cellules activées est prioritaire. D'autres expériences ont été menées afin de déterminer le taux de substitution des cellules activées par des cellules néoformées dans la moelle osseuse. Dans ce cas, nous avons fait un transfert simultané de cellules B ganglionnaires et de cellules de MO portant un allotype différent. Les résultats suggèrent un taux de remplacement assez faible, ce qui semble confirmer l'autonomie des populations activées. Par ailleurs, nous avons constaté que ces populations de cellules B activées exercent un rétrocontrôle qui empêche la différentiation terminale (en cellules sécrétrices) d'une deuxième population de cellules B et l'arrivée en périphérie des nouvelles cellules B migrant à partir de la moelle osseuse. Les mécanismes responsables de ce rétrocontrôle sont à l’étude. Il semble qu’une fois qu’une population est installée, elle est plus difficile à remplacer et elle exerce un rétrocontrôle sur les nouvelles populations de cellules; ceci suggère que la sélection des cellules B activées suit la règle de "premier arrivé, premier servi".
  3. Compétition cellulaire B (Manuela Rosado). Par définition, les phénomènes de compétition entre deux populations cellulaires doivent satisfaire au moins deux critères: a) modifier la taille relative de deux populations en compétition et b) modifier leurs dynamiques et leurs taux de survie. Nos résultats antérieurs ont démontré que la durée de vie et la taille d'une population cellulaire peuvent être modifiées en présence d'une seconde population. Nous avons pu montrer que la compétition cellulaire joue un rôle prépondérant dans la sélection des cellules B. L’homéostasie du nombre de cellules B périphériques pourrait être déterminée par une quantité limitée de ressources. La compréhension de la sélection des répertoires exige donc une nouvelle approche: l'étude des règles de compétition lymphocytaire et l’identification de type de ressources impliquées dans ces phénomènes. Nous avons abordé plusieurs questions :
  4. L'utilisation de souris transgéniques pour des molécules d'Ig dépourvues de portion variable (obtenues de M. Daniel Corcos), nous a permis de confirmer le rôle des Ig de surface dans la compétition lymphocytaire. Ces études suggèrent aussi l'existence de mécanismes de sélection positive dans la survie des cellules B périphériques au repos et le choix des répertoires d'anticorps. Plus important, ces études montrent que le BCR est essentiel à la survie des cellules B matures dans les compartiments périphériques. Il reste à déterminer quels sont les ligands reconnus qui permettent la survie des cellules B.
  5. L'étude de la réimplantation et de la compétition entre des lymphocytes B de souris déficientes pour la chaîne légère k des Igs (B6.Ig k -/-) et des cellules B d'une souris normale, semble démontrer la dominance des cellules normales portant un répertoire plus diversifié. Ceci confirme que l'une des priorités dans l'organisation du système immunitaire est de préserver une diversité maximale.
  6. Nous avons étudié le rôle du gène de survie cellulaire bcl-2 dans la sélection et la compétition des lymphocytes. Nous avons étudié la compétition entre cellules normales et cellules transgéniques pour l'oncogène bcl-2 dans des chimères de MO ainsi que l'expression de bcl-2 chez les lymphocytes à longue durée de vie. Nous avons eu la preuve formelle du rôle de bcl-2 dans le contrôle de la longévité des lymphocytes B "in vivo" et de l'avantage de ces cellules dans les phénomènes de compétition lymphocytaire.
  7. Nous ne savons toujours pas pourquoi l'exclusion allélique a été favorisée au cours de l'évolution. Nous avons établi deux lignées de souris Ig Tg sur fond Rag2-/-. A partir de ces souris, nous avons produit des souris doubles Tg sur fond Rag2-/-. Chez ces souris, les cellules B périphériques portent la spécificité SP6 (observations préliminaires). Les cellules B de ces souris expriment donc deux BcRs, ou plus, et l’intensité d’expression du marqueur idiotypique 20.5 (SP6) ou de la liaison HEL (MD4) à la surface est la moitié de l'intensité du normal. Nous avons comparé les capacités de compétition des cellules à un seul récepteur et à deux récepteurs (ou plus?) . Nos résultats indiquent qu’il y a un avantage de sélection pour les cellules portant un seul récepteur ce qui suggère que la dilution d’un récepteur diminue la capacité de la cellule à capter des signaux de survie. Nous avons aussi utilisé ces souris double Tg (MD4xSP6 sur fond Rag2-/-) pour étudier la sélection des cellules B portant deux récepteurs Ig en présence d'un auto-antigène exprimé soit sur la forme soluble (souris ML5 Tg pour HEL sur fond Rag2-/-), soit sur la forme membranaire (souris KLK3 Tg pour HEL sur fond Rag2-/- ou mMT). A la question: l’expression d’un deuxième BcR peut-elle sauver des cellules B auto-réactives de la délétion, on peut répondre : non !
  8. Homéostasie des cellules T CD4 (Afonso Almeida). Pourquoi le nombre de cellules T est-il celui que l'on observe? Est-il le résultat d'une production insuffisante de nouvelles cellules T dans le thymus? Est-il limité à la périphérie par une quantité insuffisante d'espace ou de "ressources"? Nous avons construit des souris chimériques reconstituées avec des mélanges de cellules précurseurs de moelle osseuse (MO) de souris normale et de souris TCRa ko (incapables de produire des cellules T single positives) en proportions variables. Nous avons constaté que les groupes de chimères contenant plus de 50% du nombre normal de thymocytes SP présentaient un nombre de cellules T périphériques identique à celui observé dans les conditions physiologiques normales. Le maintien du nombre physiologique de cellules T périphériques dépend cependant d'une production minimale et de l’export continu de nouvelles cellules à partir du thymus (chez les chimères avec un nombre très réduit de thymocytes SP, le nombre de cellules B périphériques est diminué). Après transfert chez des souris déficientes en lymphocytes T, les cellules T CD4 ou CD8 prolifèrent et leur nombre atteint rapidement un plateau qui reste constant. Ce système de transfert a permis de montrer que les cellules T CD8 naïves et mémoire appartiennent à des compartiments cellulaires avec des contrôles homéostatiques indépendants. Le même phénomène de prolifération et d’expansion du nombre de cellules T périphériques a été observé chez la souris suite à des traitements cytostatiques avec l'hydroxyurée (HU) ou chez les malades infectés par le VIH sous trithérapie. Nous étudions le devenir de différentes populations de cellules T CD4 suite à leur transfert chez des hôtes déficients en cellules T. Nous étudions aussi la cinétique de la prolifération des lymphocytes T CD4 matures périphériques en l’absence de l'apport thymique. Nos résultats montrent que le taux de croissance des cellules CD4+,CD45RBhigh,CD25- "naïves" est 10 fois supérieur à celui des cellules CD4+,CD45RBlow,CD25+ activées. Ils suggèrent donc que l'homéostasie des cellules CD4+,CD45RBhigh,CD25- "naïves" et CD4+,CD45RBlow,CD25+ activées est réglée de façon indépendante. Nous avons trouvé après co-transfert de cellules CD4,CD25- et CD4,CD25+ que les cellules activées peuvent réduire (supprimer) la croissance de cellules naïves co-transférées.
  9. Compétition cellulaire T CD8 (Nicolas Legrand). Les résultats que nous avons obtenus antérieurement confirment l'existence des phénomènes de compétition intra- et extra thymique parmi les cellules T. Il nous ont permis d'établir l'existence d'une hiérarchie dans la sélection périphérique des lymphocytes T CD8 en l’absence d'immunisation : non-Tg>P14>anti-HY. Nous avons préparé des souris TcR monoclonales (sur fond génétique B6.Rag2 -/-) pour le Tg aHY et le Tg aLCMV P14. Nous avons développé aussi des souris double-transgéniques (DbTg) pour l’expression de deux récepteurs des cellules T (TcR) restreints à la même molécule de classe I du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). Ces deux TcR sont spécifiques respectivement de l’antigène mâle (TcR aHY) et d’un épitope du virus LCMV (TcR P14). Chez les souris DTg femelles, 80% des cellules CD8 périphériques expriment à leur surface les deux TcR transgéniques. Il nous faut par co-modulation étudier la hiérarchie d’association entre les différentes chaînes a et b des deux TcR Tgs. Chez ces souris mâles DTg en fond Rag2-/-, nous avons étudié la sélection des lymphocytes CD8 en présence de l’antigène. Chez ces souris mâles, on détecte des populations périphériques de cellules T CD8+ qui expriment une intensité du TcR aHY (T3.70+) réduite. Nous avons conclu que la co-expression d’un deuxième TcR permet l’échappement des cellules T auto-réactives aux mécanismes de délétion intra thymique. Il nous reste à étudier l’état fonctionnel de ces cellules. Par rapport aux cellules monoclonales n’exprimant qu’un TcR (aHY ou P14), les cellules T DTg possèdent une survie diminuée lors des mises en compétition lymphocytaire. Ces résultats nous amènent à conclure que la densité du TcR peut modifier sa capacité compétitive et la survie des cellules T naïves.
  10. Mémoire T (Nicolas Legrand). Nous avons, en collaboration avec Mme Benedita Rocha, comparé les propriétés et les interactions nécessaires à la survie et à l'expansion des cellules naïves et mémoire. Dans ces études, nous avons utilisé des souris monoclonales TcR Tg (fond génétique B6.Rag2 -/-). Nous avons croisé des souris TcR-Tg portant un récepteur spécifique de l'Ag mâle, avec des souris Rag2 -/-: grâce à leur incapacité à réarranger leurs récepteurs T endogènes, ces souris contiennent exclusivement des cellules T Tg, i.e., monoclonales. Les cellules naïves sont obtenues chez les souris femelles Tg Rag2 -/-. Les cellules mémoire sont récupérées chez des souris chimères mâle/femelle (souris Rag2 -/- reconstituées avec MO de souris déficientes en cellules T CD3 -/- 10% mâles/90% femelles). Pour l’obtention de ces cellules mémoire, nous avons stimulé les cellules naïves in vivo par l'Ag mâle en les transférant à des souris chimères mâle/femelle. Ces chimères sont obtenues en reconstituant des souris Rag 2 -/- (dépourvues de cellules T et B) avec de la moelle osseuse (MO) de souris CD3eKO, qui ne génèrent que des cellules B. Ces souris sont donc dépourvues de toute cellule T endogène. Nous avons greffé 90% de MO femelle Ly 5.1 et 10% de MO mâles Ly 5.2. Nous pouvons suivre l'Ag in vivo par un marquage de surface des cellules mâles avec un anticorps anti-Ly 5.2. Après reconstitution, 10% des cellules B périphériques de ces chimères sont des cellules mâles Ly 5.2. Les cellules MoTg transférées dans un deuxième temps à ces souris sont activées, prolifèrent et éliminent des cellules Ly 5.1 mâles, générant des cellules mémoire. Dans ce système expérimental, nous pouvons suivre le devenir des cellules T Tg transférées ainsi que leur différenciation en cellules effectrices (capacité d'éliminer les cellules mâles in vivo). Dans la mesure où ces chimères sont totalement dépourvues de cellules T endogènes et ne reçoivent qu'un seul clone de cellules T Tg par voie veineuse, les seules cellules T présentes sont issues de ce clone. Par la simple déplétion des cellules B et macrophages des organes lymphoïdes périphériques de ces souris, il nous est donc possible de récupérer un nombre élevé de lymphocytes T mémoire de nos souris chimères. En collaboration avec Mme B. Rocha et le groupe de François Lemonnier de l'Institut Pasteur, nous avons étudié ces interactions après transfert de cellules naïves ou mémoire dans des hôtes différents dans leur présentation de l'antigène et dans l'expression des molécules du CMH (en utilisant des souris mutantes ko pour les gènes de CMH classe I - H2Db et H2Kb). Nous avons montré que les cellules naïves ont besoin d'interactions avec l'antigène pour se diviser et reconnaître l'élément de restriction du CMH (dans le cas de ce Tg - H-2Db) pour survivre à la périphérie (elles disparaissent chez les hôtes H-2Db ko). Donc, les interactions décrites comme nécessaires à la sélection positive dans le thymus sont aussi importantes pour la survie des cellules T naïves à la périphérie. Les cellules mémoire se divisent en l’absence de l'antigène, survivent en l’absence de l'élément de restriction, mais disparaissent en l'absence totale de CMH Classe I (après transfert chez des hôtes H-2Dbxb2-microglobuline double ko). Elles ont donc besoin d'interactions via leur TcR pour survivre. Ces résultats suggèrent que les cellules mémoire ont un seuil d'activation plus bas que les cellules naïves; ceci permet leur activation ou leur survie en l’absence d'antigène par des interactions croisées avec des peptides présentés par des molécules de classe I, autres que H2Db. Plus récemment, nous avons suivi le devenir de cellules monoclonales T CD8 P14 chez des souris double ko (CD3e-/- et H2Db ou H2Kb) et nous avons confirmé que ces cellules naïves ont aussi besoin de reconnaître l'élément de restriction du CMH (dans le cas de ce Tg - H-2Db) pour survivre à la périphérie.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

VOUGNY Marie-Christine, mcvougny@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

FREITAS Antonio, Chef de Labo IP, afreitas@pasteur.fr

Stagiaires de l'unité

ALMEIDA Afonso, étudiant thèse, aalmeida@pasteur.fr DE LA COSTE-MAURE Alix, post-doc, acoste@pasteur.fr GAUDIN Emmanuelle, étudiante thèse, egaudin@pasteur.fr LEGRAND Nicolas, étudiant thèse, nlegrand@pasteur.fr ROSADO Maria Manuela, étudiante thèse, mrosado@pasteur.fr

Autre personnel de l'unité

MAILHE Marie-Pierre, Technicienne Sup. Labo IP, mpmailhe@pasteur.fr VOUGNY Marie-Christine, Secrétaire de direction IP, mcvougny@pasteur.fr

Publications de l'unité

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