Rapport d'activité de l'unité Développement des Lymphocytes pour l'année 1999

CNRS URA 1961

Responsable : CUMANO Ana (cumano@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Les lymphocytes sont constamment générés à partir des cellules hématopoïétiques souches (CHSs). Nos objectifs sont: 1. L’isolement d’une population homogène de CHSs et la caractérisation des mécanismes de détermination de lignée au cours du processus de différenciation en lymphocytes T. 2. L’identification des ligands spécifiques reconnus par les lymphocytes Tgd. 3. La régulation du nombre total de lymphocytes T du système immunitaire périphérique et l’origine des populations lymphocytaires régulatrices qui maintiennent la tolérance aux composants du soi.

Abstract

Lymphocytes are constantly generated from hemopoietic stem cells. Our aims are: 1. The purification of stem cells and the characterisation of lineage commitment during T cell generation. 2. The identification of ligands for gd T cells. 3. The study of mechanisms underlying the regulation of numbers of T cells in the periphery and the origin of lymphocytes regulating graft rejection.

Texte du rapport

Développement hématopoïétique chez l’embryon de souris. Responsable A. Cumano.

        Les cellules sanguines sont constamment générées, dans les organes hématopoïétiques, à partir d'un type cellulaire appelé cellule hématopoïétique souche (CHS) qui est multipotent, capable de se différencier en érythrocytes, cellules myéloïdes et lymphoïdes et qui a la capacité d'auto-renouvellement. Les CHSs se trouvent dans la moelle osseuse chez la souris adulte et dans le foie foetal, chez l'embryon. Ces organes présentent, néanmoins, une complexité cellulaire très grande et, en conséquence, la fréquence des CHSs est de l'ordre de 10-5.
        Nos objectifs sont:
        1. L’isolement d’une population homogène de CHSs à partir du local où elles sont générées, pendant le développement embryonnaire, et leur caractérisation. Les CHS d’origine embryonnaire sont en division cellulaire. Nous nous proposons d’utiliser cette propriété pour tester leur capacité à être infectées par des vecteurs rétroviraux et ainsi établir un système de transfèrt de gènes.
        2. La compréhension des mécanismes de détermination de lignée que les CHSs subissent au cours du processus de différenciation en lymphocytes T. Pour cela, nous cherchons à identifier, purifier et caractériser les précurseurs de lymphocytes T qui migrent du foie foetal au thymus. Cette population cellulaire constitue les précurseurs immédiats des thymocytes, capables de reconstituer le compartiment cellulaire T d’un individu.
        Cette étude ouvre la possibilité de manipuler une population homogène de CHS et des précurseurs éventuellement déterminés dans la voie de différenciation lymphocytaire T. La capacité de contrôler le devenir de ces précurseurs aura des implications importantes dans les situations pathologiques où la greffe de cellules hématopoïétiques est la thérapie de choix. Cette thérapie est importante dans le traitement des immunodéficiences, dont le SIDA.
        Les CHS d’origine embryonnaire et leurs progéniteurs déterminés sont en division cellulaire active, ce qui leur confère la capacité d’être infectées par des vecteurs rétroviraux. Cette caractéristique présente donc un avantage par rapport aux CHSs de la moelle osseuse adulte qui sont plutôt au repos. Ces cellules deviendront alors un outil précieux une fois administrées aux patients: comme source de cellules capables de reconstituer le système hématopoïétique en général ou exclusivement de précurseurs de lymphocytes T. Les CHSs d’origine embryonnaire constituent une source enrichie de cellules immuno-incompétentes qui vont mûrir dans le nouvel organisme, sans les dangers de réaction de greffe contre l'hôte.
        Nous avons détecté des cellules hématopoïétiques multipotentes dans le mésoderme intraembryonnaire, autour du mésenchime aortique, avant le peuplement du foie foetal. Cette région dénommée Splanchnopleure (Sp)/Aorte, Gonades, Mésonephros (AGM) est peut-être le seul endroit de génération de novo de cellules hématopoïétiques souches. Des expériences de dilution limite ont montré que ces précurseurs multipotents augmentent en nombre, avec le stade de développement de l'embryon alors que nous n’observons aucune activité de différenciation. Cette activité de génération de cellules souches atteint un niveau maximal au 10.5ème jour de gestation puis décroît rapidement pour s’éteindre vers le 12.5ème de gestation (6).
        Les CHSs fondatrices de l’hématopoïèse définitive sont donc originaires du mésoderme intraembryonnaire. Les CHSs arrivent au foie fœtal entre le 10ème et le 11ème jour de la gestation et au thymus vers le 11ème jour de la gestation. Le thymus reçoit un apport constant de précurseurs qui doivent migrer du foie foetal, après extinction de la région paraaortique comme source de cellules souches. Pour identification ultérieure des précurseurs des thymocytes dans le foie foetal, nous avons déterminé le nombre de précurseurs de cellules T dans le foie. Avec des outils d'analyse unicellulaire dans des systèmes de culture qui permettent la détermination de la fréquence des précurseurs de cellules T, nous avons montré que le nombre de précurseurs de lymphocytes T augmente à partir du 11ème jusqu’au 13ème jour de la gestation, dans le foie foetal. A partir de ce jour, ce nombre diminue. Cette réduction est concomitante à une augmentation du nombre de précurseurs T dans le thymus embryonnaire dont l’ampleur ne peut pas être expliquée par simple division cellulaire in situ. Nous avons caractérisé le potentiel de différenciation des précurseurs de lymphocytes T présents dans le foie fœtal à jour 14 et 15 de gestation. Après un tri cellulaire de différentes populations, nous avons utilisé des cultures in vitro qui permettent la différenciation de précurseurs multipotents en cellules T, B, NK et myéloïdes, en conditions de dilution limite, ce qui permet une analyse aussi bien qualitative que quantitative de ces précurseurs (6, 7), en collaboration avec l’Unité de J. DiSanto.
        Nous avons ainsi obtenu une distribution du nombre de précurseurs T dans les différents sous-ensembles cellulaires du foie fœtal. Parmi 7 populations caractérisées, une d’entre elles correspond aux caractéristiques attendues d’un précurseur déterminé dans la voie T/NK de différenciation. Elles constituent environ 0.5-0.1% des cellules du foie fœtal, mais contiennent à ce stade d’enrichissement 60% des précurseurs T. Cette population est capable de générer des lymphocytes T et NK in vitro à une fréquence de 1:15, des cellules B et myéloïdes à une fréquence de <1:5.000. L’injection de ces cellules dans des souris irradiées Rag2-/-gc-/-, déficientes en lymphocytes et en cellules NK, permet non seulement la reconstitution exclusive (et avec une haute efficacité) des compartiments T et NK de la rate et du thymus, mais aussi la génération de lymphocytes Tab CD8aa et gd de l’épithélium intestinal d’origine extra-thymique. L'environnement thymique de la souris nu/nu est incapable de soutenir une différenciation des lymphocytes T. La population que nous venons d’isoler est présente en nombre identique à celui des souris normales dans des embryons de souris nu/nu. Cette observation nous permet donc de postuler la nature pre-thymique de ces cellules. C'est la première fois que la présence de précurseurs déterminés dans la lignée T/NK a été démontrée dans un organe hématopoïétique.

Développement du processus de tolérance. Responsable A. Bandeira

Nos projets portent sur trois thèmes: 1. Tolérance dominante induite par un épithélium thymique allogénique: ontogénie et physiologie des cellules T régulatrices; 2. Régulation du nombre total de lymphocytes T du système immunitaire périphérique; origine et physiologie des populations lymphocytaires régulatrices naturellement activées; lien entre les cellules régulatrices qui maintiennent la tolérance aux composants du soi et celles qui régulent les réponses immunitaires au niveau des muqueuses; 3. Rejets de tissus embryonnaires.

1. Tolérance induite par l’épithélium thymique allogénique: ontogénie et physiologie des cellules T régulatrices. L'ensemble de nos travaux expérimentaux dans le domaine de la tolérance induite par un épithélium thymique (ET) allogénique nous a conduit à établir deux principes majeurs concernant d’une part, le processus de sélection thymique et, d’autre part, l’ontogénèse de la tolérance périphérique. Nous avons démontré que la tolérance induite par l’ET se fait sans que des lymphocytes T spécifiques de l'haplotype du CMH de l'ET ne soient délétés, et que des cellules T suppressives/régulatrices sélectionnées exclusivement par l'ET, étaient impliquées dans la tolérance vis-à-vis de plusieurs tissus périphériques. Ces observations ont ainsi établi un lien entre sélection positive intrathymique et tolérance périphérique car elles impliquent, dans le processus d'induction de tolérance thymique (centrale), des mécanismes de tolérance "dominante" jusqu'alors uniquement considérés dans l'établissement de la tolérance périphérique. La découverte de cellules T régulatrices sélectionnées par l'ET permet non seulement une nouvelle compréhension de la sélection positive des répertoires de cellules T dans le thymus, car elle implique des interactions TCR/ligand de haute affinité, mais procure aussi les bases pour analyser les stratégies suivies par l’ET dans l'induction de la tolérance aux antigènes non présents dans le thymus. Ces principes ont permis de définir un modèle théorique capable d'expliquer l'établissement, au cours du développement, de la tolérance aux antigènes du soi exprimés dans le thymus ou bien exclusifs d’un tissu périphérique, ainsi que son maintien chez l'adulte. Ce modèle repose sur des concepts de tolérance "dominante" à la périphérie (impliquant des mécanismes actifs de régulation) et invoque (i) l'origine et la sélection intra-thymique des premières cellules T autoréactives régulatrices; (ii) une dynamique de populations caractéristique de l'établissement des répertoires pour générer la « connaissance » du soi antigénique au cours du développement et en maintenir une mémoire dynamique pour la vie. Considérant la tolérance centrale et périphérique comme le résultat de programmes développementaux, les études à entreprendre ont pour but de caractériser la composition cellulaire hétérogène (et variable) du stroma thymique, les règles d'activation des précurseurs et des lymphocytes T et la régulation des fonctions effectrices par le micro-environnement, ainsi que la dynamique des populations Nos études actuelels développent les thèmes suivants: (1) l’ontogénie de génération de cellules T régulatrices; (2) l’identification et l’isolement des cellules T régulatrices sélectionnées dans le thymus; (3) l’étude des mécanismes de suppression et d’éducation des cellules T non-tolérantes par les cellules T régulatrices.
2. Régulation du nombre des lymphocytes: Etude de la dynamique des populations lymphocytaires CD4 naïves et naturellement activées dans le cadre de la maladie inflammatoire de l’intestin. Les tissus et organes des organismes multicellulaires sont sous la régulation stricte du nombre de cellules totales. Une des questions clé toujours à l’étude dans la physiologie du système immunitaire est de savoir comment opèrent les mécanismes homéostatiques qui contrôlent le nombre des lymphocytes. Plusieurs maladies autoimmunes ont été associées à des immunodéficiences caractérisées par une lymphopénie. Nous pensons que l’état naturel de tolérance aux antigènes spécifiques aux tissus est basé sur l’existence de mécanismes régulateurs qui préviennent la différenciation et la prolifération incontrôlée des clones de cellules T agressives et réactives au soi. Nous suggérons que des cas de lymphopénie peuvent provoquer la disparition des circuits dépendants des cellules T régulatrices qui contrôlent normalement les cellules T auto-réactives. Dans cette perspective, les maladies autoimmunes doivent être considérées comme des formes d’immunodéficience. Des modèles murins pour une maladie humaine appelée colite ulcérative, une forme de maladie inflammatoire des intestins (IBD) ont aussi montré le rôle des mécanismes de contrôle des cellules T qui régulent les réponses immunitaires développées par des lymphocytes T naïfs dans la muqueuse de l’intestin contre les antigènes de la flore intestinale ou de la nourriture. Une dérégulation de ce processus conduit à la maladie et la mort de l’animal. Nous voulons savoir si les mécanismes régulateurs qui contrôlent en général le nombre de lymphocytes T périphériques sont les mêmes qui régulent la tolérance périphérique aux antigènes du soi ainsi que les réponses immunes au niveau des muqueuses. L'ensemble de nos études actuelles sont centrées sur 1) la quantification du potentiel d’expansion in vivo des cellules CD4 naturellement activées et celui des populations CD4 naïves; 2) le devenir des populations de cellules T naïves (potentiellement agressives) en présence de cellules T régulatrices dans des expériences de co-transfert; et 3) l’identification et l’isolement des cellules T régulatrices naturelles dans le thymus et à la périphérie. Nous avons analysé les cinétiques d’expansion des différentes sous-populations (soit indépendamment transférées ou co-transferées) en prenant en considération leurs localisations anatomiques dans les différents organes lymphoïdes périphériques et notamment au niveau de l'intestin. L'ensemble de ces études nous a permis de conclure que 1) la sous-population de cellules T CD4+ activées/mémoire, qui contient les cellules T régulatrices, a un faible potentiel de prolifération in vivo ; 2) elles inhibent non seulement la prolifération des cellules T engagées dans des réponses immunitaires mucosales mais aussi leur migration massive dans la paroi intestinal et donc le déclenchement de la maladie; 3) des souris germ-free contiennent des cellules CD4 T régulatrices; 4) l’expansion de cellules T à la périphérie de receveurs nouveau-nés est très fortement diminuée. Ces premières études montrent donc que les cellules T CD4+ régulatrices contrôlent la taille du compartiment des cellules T CD4 activées/mémoires et qu’au moins une partie des cellules régulatrices est auto-réactive. Elles suggèrent aussi que les expansions périphériques des cellules T chez des receveurs dépourvus de cellules T représentent des réponses immunitaires classiques contre des antigènes exogènes, et que l’amplitude de ces expansions est dépendante du nombre de cellules T régulatrices et de la charge antigénique. Ceci met donc en cause la notion de « régénération » du système immunitaire T périphérique.
3. L’Epithélium thymique (ET) est un tissu susceptible d’être rejeté par un système immunitaire adulte. Etant donné les caractéristiques uniques de l’ET dans l’induction de tolérance, nous avons greffé des ébauches embryonnaires d’ET avant toute colonisation par des cellules hématopoïétiques (CH) chez des souris adultes allogéniques. L’étude d’un nombre considérables d’animaux a démontré que l’ET est rapidement détruit. Ceci s’est avéré être aussi le cas pour des greffes de coeur d’embryon de jour 8. A ce jour, l’établissement de la circulation ne s’est pas encore fait ce qui implique l’absence dans les tissus de cellules d’origine hématopoïétique (HC) présentatrices d’antigène. Le concept jusqu’ici considéré est de que les tissus déplétés de ce type de cellules ne sont pas rejetés. Ce concept est basé sur les résultats obtenus dans plusieurs systèmes expérimentaux de tolérisation induite par des traitements chimiques (e.g. 2-deoxiguonosine) ou physiques de différents types de tissus. Nos résultats ne sont donc pas compatible avec ce concept et impliquent outre la déplétion de CH, des effets tolérisants directs de ces traitements sur les cellules. Des analyses de cytométrie de flux des infiltrats des tissus embryonnaires montrent en nombre considérable des lymphocytes T CD4+ et surtout CD8+ activés et sécrétant plusieurs interleukines du type TH1. Par ailleurs, le même type d’étude portant sur des greffes de thymus d’un embryon de 14 jours traité avec la 2-deoxiguanosine, montre que ces tissus sont eux aussi infiltrés par des lymphocytes CD4+ et CD8+ ayant un phénotype activé, malgré le fait que ces tissus traités soient acceptés par des receveurs allogéniques immunocompétents. Ces études montrent que les tissus traités à la 2-deoxiguanosine ne sont pas ignorés par le système immunitaires du receveur à l’opposé de ce que l’on pensait. Nos études actuelles essayent de documenter le type d’interleukines produites par les lymphocytes infiltrants ainsi que leur devenir.

Biologie du Développement des lymphocytes T gd. Responsable P. Pereira.

        La recherche que nous menons depuis quelques années porte sur différents aspects de la physiologie des lymphocytes Tgd. Notre travail est centré sur deux questions majeures concernant cet ensemble lymphocytaire: 1) Quels sont les ligands spécifiques reconnus par les cellules Tgd et 2) Quelles sont les étapes de différentiation et de sélection suivies par les cellules Tgd dans leur développement?
        En ce qui concerne la caractérisation de leurs ligands spécifiques, nous avons poursuivi l'identification des gènes qui contrôlent la représentation des différentes sous-populations de cellules Tgd dans l'intestin de souris. Nous nous sommes intéressés tout particulièrement à la localisation d'un gène lié au Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH). A ce jour, nous avons produit et analysé quatorze souris recombinantes dans le CMH, ce qui nous a permis de localiser ce gène dans l'intervalle H2K-H2D du CMH et, plus précisément, entre le gène H2K et celui codant pour le Tnf.
        Nous avons aussi continué la caractérisation d'une sous-population de cellules Tgd que nous avions découverte il y a quelques années. Les cellules appartenant à cette sous-population présentent deux caractéristiques particulières. Elles sont capables de produire des cytokines du type Th2 (ex. IL 4 et IL 10) et expriment un répertoire TCR très restreint. Cette année, nous avons pu montrer que l’homogénéité de ce répertoire TCR est due, principalement, à une sélection positive des cellules exprimant ce TCR. Nous avons aussi cloné les gènes réarrangés g et d exprimés par un hybridome T appartenant à cette population et injecté ces clones dans des oeufs fécondés afin d'obtenir des souris transgéniques exprimant ce récepteur. Nous avons déjà obtenu des souris portant dans leur ADN soit les deux gènes g et d réarrangés, soit uniquement l'un de ces 2 gènes. Bientôt, nous serons en mesure d'analyser l'expression fonctionnelle de ces gènes. Ces souris devraient être de grande utilité dans les études de la sélection et la fonction de cette sous-population Tgd.
        Par ailleurs, nous avons réalisé une analyse systématique des gènes influençant la représentation de cette population dans le thymus. Nos résultats ont montré un rôle prépondérant de deux régions génomiques localisées dans les chromosomes 13 et 17.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

VOUGNY Marie-Christine, 8593, mcvougny@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

CUMANO Ana, DR2 Inserm, cumano@pasteur.fr BANDEIRA Antonio, CR1 CNRS, bandeira@pasteur.fr PEREIRA Pablo, CR IP, ppereira@pasteur.fr

Stagiaires de l'unité

ANDRE Isabelle, Post-Doc
ANNACKER Oliver, Eutidant thèse
BARRETO Vasco, Etudiant thèse
BRISSAC Caroline, Etudiante thèse
DOUAGI Iyadh, Etudiant thèse
GRIGORIADOU Kalliopi, Etudiante thèse
PIMENTA-ARAUJO Ricardo, Etudiant thèse

Autre personnel de l'unité

BURLEN-DEFRANOUX, Ingénieur IP
BOUCONTET Laurent, Technicien Sup. Labo IP VOUGNY Marie-Christine, Secrétaire de direction IP

Publications de l'unité