Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Chimie organique pour l'année 1999

CNRS URA 2128


Responsable : HUYNH-DINH Tam (hdt@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Les travaux de l’Unité de Chimie Organique concernent la synthèse et l’étude de trois classes importantes de composés biologiques : nucléosides ou nucléotides, peptides et sucres. L’accès à ces molécules permet de déterminer leurs structures et leurs interactions avec différents ligands, en vue du développement de vaccins synthétiques ou d’inhibiteurs d’enzymes. Un programme d’évolution dirigée de polymérases a démarré cette année.

Abstract

The Unit of Organic Chemistry is involved in three important classes of biological compounds : nucleosides or nucleotides, peptides and sugars. The synthesis of these molecules permit the study of their structures or conformations and their interactions with different ligands ; the final goal is the development of synthetic vaccines or enzyme inhibitors. A program on directed evolution of polymerases started this year.

Texte du rapport

Réplication d'acides nucléiques chimiquement diversifiés (S. Pochet)

Notre activité de recherche vise à produire de nouveaux types d'acides nucléiques in vitro à partir de la plus grande variété chimique possible de nucléotides, les monomères étant incorporés par action des ADN polymérases. Deux types d'altérations de l'ADN ont été abordés : la première concerne la partie hétérocyclique du nucléoside et devrait permettre d'établir la structure d'une base ambiguë qui s'apparie aux quatre bases canoniques au stade de l'incorporation comme monomère triphosphate, puis lors de sa copie comme matrice. Le désoxynucléoside triphosphate (dMTP) d'une telle base ambiguë (M) permettrait de substituer toute base canonique par n'importe laquelle des trois autres lors de la réplication par une ADN polymérase. Pour cela nous avons exploité le schéma d'appariement de l'imidazole-4-carboxamide dont nous avons montré précédemment les appariements alternatifs. Des hétérocycles capables de s'auto-apparier sont également étudiés. La deuxième modification abordée concerne le squelette phosphopentose. L'objectif général est d'élargir la gamme des chaînes nucléiques qui peuvent être amplifiées par PCR. Les analogues anhydrohexitol (HNA) ont été choisis comme premier motif à faire accepter par l'ADN polymérase. Un deuxième motif consistant en l'enchaînement de deux nucléosides via une laison carbamate (dinucléoside triphosphate) est également en cours d'exploration.

Analogues de nucléotides comme inhibiteurs d’enzymes (S.R. Sarfati)

Nous avons achevé la synthèse d’analogues de l’UDP-glucose dans le but de les utiliser comme vecteurs de l’AZTMP et de l’AZTDP. Les deux isomères alpha-borano phosphates de chacun des couples ont été séparés par HPLC. Parallèlement, nous avons préparé les analogues alpha -borano di et tri-phosphate de l’AZT, du d4T et du 3TC afin d’étudier leur affinité pour deux enzymes cellulaires importantes, la nucléoside diphosphate kinase (NDPK) et la transcriptase inverse (RT). Au cours de ce travail, nous avons élucidé la structure par diffraction aux rayons X du d4TDP et celles des isomères de l’AZTDP alpha -borano phosphate, au moyen de co-cristaux obtenus avec la NDPK. Cette étude nous a permis de montrer que : 1) les d4T diphosphate et triphosphate sont respectivement meilleurs substrats de la NDPK et de la RT que l’AZTDP et l’AZTTP 2)l’isomère RP alpha -borano phosphate est meilleur substrat de ces deux enzymes que son analogue non-borano. De plus, nous avons trouvé qu’après incorporation de l’AZTTP alpha -borano phosphate, isomère RP, à un oligonucléotide, la fonction phosphodiester formée était beaucoup plus résistante à la pyrophosphorolyse que la liaison phosphodiester normale.

Oligonucléotides (T. Huynh-Dinh)

La synthèse d’oligoribonucléotides en épingle à cheveux a été poursuivie pour l’étude d’une part de leur conformation et stabilité structurale par différentes techniques spectroscopiques (RMN, IR, Raman) et d’autre part des interactions ARN-ARN (complexe dimérique boucle-boucle) ou ARN-protéine en vue de la compréhension du rôle de la nucléocapside NCp7 de VIH dans ses différentes fonctions. La circularisation par des ligations enzymatique et chimique (en solution et sur support solide) de différents oligodésoxynucléotides a été entreprise en vue de l’étude des complexes de pontage interbrins du trans-dichloroplatine. Enfin, nous collaborons aussi à différents projets de construction de réseaux d’oligonucléotides sur support solide (puces à ADN) par une synthèse in situ (photolithographie ou microprojection) ou ex situ (accrochage covalent d’oligonucléotides fonctionnalisés).

Synthèse peptidique (F.Baleux)

Notre contribution dans le domaine des récepteurs de chimiokines consiste en la synthèse de dérivés de SDF1 pour étudier leurs interactions avec son récepteur CXCR4. Les glycoaminoglycanes de la surface cellulaire semblent moduler les propriétés biologiques des chimiokines. Nous avons déterminé pour SDF1 sa constante d’affinité pour l’héparine ainsi que les acides aminés impliqués dans cette interaction par synthèse de différents mutants. Le mutant 3/6, dépourvu totalement d’affinité pour l’héparine et qui conserve cependant la structure tridimensionnelle de SDF1 ainsi qu’une certaine capacité inhibitrice du virus VIH, devrait nous permettre de déterminer le rôle exact des glycoaminoglycanes lors de l’infection VIH via le couple CD4/CXCR4. Dans un autre axe de travail est étudiée l’utilisation de peptides synthétiques comme mimes de polysaccharides dans le but de mettre au point un vaccin synthétique contre la shigellose. Ces séquences peptidiques, sélectionnées à partir d’une librairie, sont présentées via le système MAP (Multiple Antigene Peptide) afin d’évaluer leur pouvoir immunogène. Enfin, nous avons réalisé la synthèse totale d’un antibiotique produit par E.coli, la microcin C7, molécule comportant un peptide lié à une adenosine via une liaison phosphoramide.

Polyosides bactériens et développement de vaccins synthétiques chimiquement définis (L. Mulard)

La nécessité d'un vaccin contre l’infection par Shigella flexneri sérotype 2a est l'une des priorités de l'OMS dans le cadre du développement de vaccins entériques. La protection contre l'infection est essentiellement médiée par une réponse dirigée contre la partie Ag-O du LPS. La notion d’épitope protecteur, et par conséquent son utilisation dans la conception d'un vaccin sous-unité, a pu être définie. La caractérisation de cet(s) épitope(s) protecteur(s) est en cours au laboratoire pour les polyosides spécifiques des bactéries Shigella flexneri sérotype 5a (modèle) et Shigella flexneri sérotype 2a, dont les unités répétitives sont des pentasaccharides ramifiés. Nous avons entrepris de synthétiser par voie chimique et de caractériser par analyse structurale en solution, des oligosides représentant diverses séquences de ces deux Ag-O. Tous sont préparés à l'échelle de la centaine de milligrammes. Les fragments di- et trisaccharides requis en série S. flexneri sérotype 5a comme en série S. flexneri sérotype 2a ont été préparés et caractérisés. Nous avons achevé deux enchaînements complets (di-, tri-, tétra-, et pentasaccharides) des fragments spécifiques de S. flexneri sérotype 5a. La synthèse des tétra- et pentasaccharides restant est en cours. De même, nous travaillons à la synthèse de plusieurs fragments tétra- et pentasaccharide en série 2a.

Mise au point de vaccins synthétiques antitumoraux (D. Cantacuzène)

Afin de pallier les défauts des conjugués protéiques classiques, nous avons développé un nouveau type d’immunogène synthétique, le MAG (Multiple Antigen Glycopeptide) où l’épitope saccharidique d’intérêt (i.e. le marqueur tumoral) est présenté de façon multivalente sur un squelette non immunogène en association avec un épitope T peptidique. Le modèle choisi comporte l’antigène tumoral Tn (a-GalNAc-Ser/Thr), fortement exprimé dans plusieurs cancers, conjugué avec un épitope T du virus de la polio (PV). Nous avons préparé un MAG comportant un motif tri-Tn de façon à améliorer l’efficacité des composés en mimant les aggrégats naturels que forment les marqueurs tumoraux saccharidiques. Ces MAG induisent une meilleure réponse anticorps que le dérivé mono-Tn et donnent une bonne protection anti-tumorale. D’autre part, la préparation d’autres dérivés MAG est en cours dans lesquels : 1) le PV est remplacé par un épitope T CD4+ dit " universel " en vue de s’orienter vers des MAGs utilisables chez l’homme 2) un épitope T CD8+ est associé à l’épitope CD4+ de façon à induire une réponse cytotoxique, reconnue comme essentielle à l’efficacité d’une immunothérapie anti-cancéreuse.

Evolution dirigée d’enzymes (J.L. Jestin)

Le projet vise à modifier les propriétés d’enzymes et d’ADN-polymérases en particulier pour obtenir des catalyseurs nouveaux et utiles en chimie ou en biotechnologies. L’ingéniérie des enzymes sera faite par évolution dirigée de protéines. L’approche est interdisciplinaire dans la mesure où elle fait appel (i) aux techniques d’expression de protéines à la surface de phages ou virus filamenteux pour la préparation de banques de polymérases, (ii) à la synthèse organique de substrats modifiés pour lier covalemment un substrat à l’enzyme et pour sélectionner les catalyseurs recherchés, (iii) à une étude biochimique des enzymes isolées et purifiées par analyse cinétique des réactions chimiques. Dans le cadre de l’année 1999, nous avons optimisé l’expression de polymérases à la surface de phages filamenteux d’un facteur 200 après avoir sélectionné des phagemides appropriés et adapté les conditions de culture des bactéries-hôte des phages filamenteux. De plus, les premières banques d’ADN polymérases exprimées à la surface de phages filamenteux ont été construites.

Enseignement

L’Unité participe à un enseignement du Secteur Bioorganique et Biotechnologies à l’Ecole Nationale Supérieure de Paris.

Mots clés

Vaccins synthétiques
Peptides
Oligonucléotides
Evolution in-vitro
Nucléosides modifiés

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

GARNIER Marie-Ange

Chercheurs de l'unité

BALEUX Françoise, CR IP
BAY Sylvie, Assistante IP
CANTACUZENE Danielle, DR2 CNRS
HUYNH-DINH Tam, DR1 CNRS
JESTIN Jean-Luc, Assistant IP
KAMINSKI Pierre Alexandre, CR IP
MULARD Laurence, CR IP
POCHET Sylvie, CR1 CNRS
SARFATI S. Robert, DR2 CNRS

Stagiaires de l'unité

CADENA AMARO Claudio, Stagiaire
COSTACHEL Corina, Thèse
MARCEL-PEYRE Véronique, Post-doc
PERRIER Sandrine, Thèse
STROBEL Heike, Post-doc
VICHIER-GUERRE Sophie, Post-doc

Autre personnel de l'unité

COIC Yves-Marie
DELAFOND Nathalie
DUGUE Laurence
FANTINI Emmanuelle
GOUYETTE Catherine
GROH François
GUERREIRO Catherine
HELYNCK Olivier
HUTEAU Valérie
PATRICIO Francesco
POINT Vanessa
RAGHOUBER Josiane
UGHETTO-MONFRIN Joël, CNRS

Publications de l'unité

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