Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Biochimie structurale pour l'année 1999

CNRS URA 2185


Responsable : ALZARI, Pedro M. (alzari@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Les travaux de recherche de l'Unité de Biochimie Structurale sont orientés à l'étude de la structure tridimensionnelle de protéines et la spécificité des interactions protéine-ligands par les moyens de la cristallographie des rayons-X, la biochimie des protéines, la microcalorimétrie et la modélisation moléculaire. Les thèmes centraux de recherche comprennent l'enzymologie structurale de microorganismes pathogènes (mycobactéries, trypanosomatides) et la reconnaissance moléculaire de sucres en différentes systèmes biologiques.

Abstract

The research activities of the Unit of Structural Biochemistry are oriented towards the study of the three-dimensional structure and ligand-binding specificity of proteins by X-ray crystallography, protein biochemistry, microcalorimetry and molecular modelling techniques. The major themes of research involve structural studies of enzymes from microbial pathogens (mycobacteria, trypanosomatids), bacterial glycosidases and protein-carbohydrate complexes in different biological systems. Results obtained during the last year include the crystal structures of the major horse allergen Equ c 1, the surface sialidase from Trypanosoma rangeli, the complex between a protective anti-cholera antibody and its saccharidic antigen, and the atomic (0.94 Å) resolution structure of a bacterial cellulase in complex with substrate.

Texte du rapport

Trans-sialidases de trypanosomes (M.F. Amaya, A. Buschiazzo, P.M. Alzari)

Les protozoaires flagellés Trypanosoma cruzi, l'agent causal de la maladie de Chagas dans le continent américain, et T. brucei, l'agent de la maladie du sommeil en Afrique, expriment une trans-sialidase de surface capable de catalyser le transfert d'acide sialique entre différentes glycoprotéines. L'expression de cette enzyme chez T. cruzi est directement liée au pouvoir d'infection du parasite. Nous avons entamé l'analyse structurale d'enzymes homologues de trypanosomatides pathogènes (T. cruzi, T. brucei) et non-pathogènes (T. rangeli) afin de comprendre les bases moléculaires de l'activité de transglycosylation (synthèse de polysaccharides) et de permettre la conception rationnelle d'inhibiteurs pouvant servir à des fins thérapeutiques. Au cours de cette dernière année, nous avons déterminé la structure 3D de la sialidase naturale de T. rangeli à haute résolution, et les essais de cristallisation sont en cours pour les enzymes recombinantes de T. cruzi et T. rangeli. L'analyse structurale comparative sialidase/trans-sialidase nous a permis de proposer la présence d'un site additionnel de fixation du substrat dans la trans-sialidase, qui pourrait expliquer l'activité de transfert d'acide sialique chez les trypanosomatides pathogènes. Afin de tester cette hypothèse, nous avons réalisé différents mutants ponctuels des enzymes de T. cruzi et T. rangeli, dont la caractérisation enzymologique et structurale est actuellement en cours.

Enzymes mycobactériennes (B. Boitel, M. Ortiz, B.G. Guimaraes, T. Nguyen, P.M. Alzari)

En s'appuyant sur les résultats génomiques, nos études visent à élucider la structure tridimensionnelle d'enzymes mycobactériennes étant (ou pouvant être) associées à la pathogénicité et à la virulence de M. tuberculosis, afin de comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents et de contribuer au développement des nouveaux outils thérapeutiques. En collaboration avec l'Unité de Génétique Moléculaire Bactérienne (IP) et le Laboratoire du Chimie Structurale des Macromolécules (IP), nos travaux portent sur deux enzymes impliquées dans les mécanismes de résistance aux antibiotiques (la catalase-peroxydase KatG et l'alkyl hydroperoxyde réductase AhpC) et sur la famille de Sérine/Thréonine protéines kinases (STPK) impliquées dans la signalisation intracellulaire. Au cours de la dernière année, nous avons continué la caractérisation fonctionnelle in vitro et les essais de cristallisation de KatG et d'Ahpc. Par ailleurs, l'ensemble de gènes codant pour les domaines catalytiques des STPKs dans le génome de M. tuberculosis ont été sous-clonés dans des vecteurs d'expression bactériens appropriés et, pour certains, les protéines recombinantes ont pu être obtenues sous forme soluble. La caractérisation biochimique et fonctionnelle de celles-ci, ainsi que les essais de cristallisation, sont en cours.

Etude structurale du facteur inducteur d'apoptose AIF, représentant d'une nouvelle famille d'oxydoréductases (M.J. Mate Perez, M. Ortiz, B. Boitel, D. Tello, P.M. Alzari)

La mitochondrie joue un rôle clé dans la régulation de l'apoptose ou mort cellulaire programmée. Les facteurs mitochondriaux impliqués dans ce processus incluent le cytochrome c, certaines procaspases et le facteur inducteur d'apoptose AIF. Grâce aux travaux de l'équipe de G. Kroemer à Villejuif et de H. Lorenzo dans notre laboratoire, ce dernier a été identifié comme étant une flavoprotéine homologue à une famille d'oxydoréductases bactériennes. La protéine AIF recombinante est capable d'induire la condensation de chromatine dans des noyaux isolés et la fragmentation à grande échelle de l'ADN, ainsi que la libération des protéines apoptogéniques (cytochrome c, caspase-9) à partir des mitochondries purifiées. L'objectif central de notre étude est de caractériser structuralement le facteur murin inducteur d'apoptose AIF et des enzymes mycobactériennes homologues, afin de comprendre les mécanismes catalytiques de cette nouvelle famille d'oxydoréductases et leur rôle dans l’initiation et la régulation de l'apoptose. Au cours de cette dernière année, nous avons cristallisé une forme recombinante tronquée - mais active - du facteur AIF murin, dont l'étude cristallographique est en cours, et nous avons démarré le clonage et l’expression de quatre gènes homologues de M. tuberculosis.

Le cellulosome de Clostridium thermocellum (B. G. Guimaraes, H. Souchon, P.M. Alzari)

La bactérie thermophile anaérobie C. thermocellum synthétise un système enzymatique, le cellulosome, capable de dégrader la cellulose cristalline. Le cellulosome est composé de plusieurs sous-unités catalytiques (glycosidases) et non-catalytiques associées sous la forme d'un complexe muliti-protéique de haut poids moléculaire. En collaboration avec l'Unité de Physiologie Cellulaire (IP), nous travaillons depuis plusieurs années sur l'analyse structurale et fonctionnelle des différents sous-unités du complexe afin de comprendre les bases moléculaires de l'hydrolyse de polysaccharides et la spécificité des interactions protéine-protéine et protéine-sucre au sein du complexe. Au cours de cette année, nous avons poursuivi nos études structurales et thermodinamiques des interactions cohésine-dockérine responsables de l'assemblage macromoléculaire du cellulosome, et nous avons cristallisé et déterminé la structure tridimensionnelle de la composante enzymatique plus importante du complexe - la cellobiohydrolase CelS - à 2.2 Å de résolution.

Reconnaissance moléculaire de sucres (H. Souchon, D. Tello, M.B. Lascombe, P.M. Alzari)

Au cours de cette année, nous avons complété l'affinement cristallographique à résolution atomique de deux formes cristallines de l'endoglucanase bactérienne CelA. La structure du complexe entre un mutant inactif de l'enzyme et le substrat cellopentaose a été affiné à 0.94 Å de résolution, et l'analyse des données de diffraction MAD à 1 Å de résolution (en utilisant des rayons X à trois longueurs d'onde différentes) nous a permis d'obtenir une carte de densité électronique à résolution atomique non biaisée par l'introduction à priori d'un modèle de la protéine. Ces études nous ont permis de définir le mécanisme catalytique de l'enzyme, dans lequel la distorsion de l'oligosaccharide lié au site actif jouerait un rôle stabilisateur de l'état de transition réactionnel, et d'analyser le rôle précis des molécules d'eau dans l'affinité et la spécificité des interactions protéine-carbohydrate. L'antigène Tn (a-Gal-NAc-O-Ser/Thr) est un marqueur spécifique des cellules cancéreuses. En collaboration avec l'Unité de Chimie Organique (IP), nous avons étudié la spécificité des interactions des glycopeptides Tn avec des lectines de plantes et des anticorps anti-Tn produits par immunisation avec des cellules du cancer de sein. Ces études montrent que les lectines reconnaissent essentiellement le monosaccharide GalNAc, tandis que l'épitope minimal reconnu par les anticorps doit inclure au moins deux résidus Tn adjacents dans la séquence polypeptidique. Nous avons aussi cristallisé et déterminé la structure tridimensionnelle de la lectine B4 de Vicia villosa complexée avec l'antigène Tn à 2.5 Å de résolution. L'analyse de cette structure confirme les résultats antérieurs, et montre que la spécificité de la lectine pour Tn peut être expliquée par la formation d'une liaison hydrogène additionnelle entre la protéine et la partie peptidique de l'antigène Tn. Nous avons aussi cristallisé l'anticorps monoclonal anti-cholera S-20-4 (IgG1, l) dirigé contre le lipopolysaccharide du serotype Ogawa (collaboration avec l'Unité de Cholera et Vibrions, IP, et le Laboratory of Medicinal Chemistry, NIH, USA). La structure tridimensionnelle du fragment Fab de cet anticorps a été déterminée à 2.3 Å de résolution, et celles des complexes avec des methyl-a-glycosides synthétiques de la chaîne d'O-polysaccharides (antigène-O) du serotype Ogawa à 2.3 Å (Fab-monosaccharide) et à 2.8 Å (Fab-disaccharide). L'analyse structurale et les études en solution des complexes antigène-saccharides montrent que le résidu perosamine terminal de l'antigène-O, lié à une cavité au centre du paratope, est la composante principale du déterminant antigénique. Le complexe est stabilisé par plusieurs liaisons hydrogène et par l'interaction hydrophobe entre le groupe méthyle à la position C2 du sucre et des résidus aromatiques de l'anticorps. La présence de ce groupe méthyle étant la principale différence chimique entre les lipopolysaccharides des serotypes Ogawa et Inaba, cela explique la spécificité serotypique fine des anticorps anti-Ogawa.

Epitopes IgE et structure tridimensionnelle de l'allergène majeur du cheval Equ c 1 (M.B.Lascombe, P.M.Alzari)

L'allergène majeur du cheval, Equ c 1, est une protéine appartenant à la superfamille des lipocalines dont le rôle physiologique serait lié à la fixation et le transport de petites molécules hydrophobes. En collaboration avec l'Unité d'Immuno-Allergie (IP), nous avons cristallisé et déterminé la structure tridimensionnelle de cet allergène à 2.3 Å de résolution. La protéine présente le motif de repliement caractéristique des lipocalines (un tonneau b à huit brins suivie d'une hélice a dans la région C-terminale) et cristallise sous une forme dimérique qui corresponde à la forme fonctionnelle de la protéine en solution. Les régions de l'allergène susceptibles de fixer les IgE humaines ont été étudiées par des tests d'inhibition/compétition avec des anticorps monoclonaux anti-Equ c 1 de souris. Nous avons ainsi pu déterminer que l'épitope dominant reconnu par les IgE de différents patients allergiques est restreint à une seule région de la surface moléculaire de l'allergène, et nous avons pu proposer la localisation de cet épitope dans la structure tridimensionnelle en étudiant la réactivité des anticorps avec différents mutants ponctuels d'Equ c 1.

Etude cristallographique de la terminal désoxynucléotidyl-transférase (N. Jourdan, N. Expert-Besançon, M. Delarue).

La terminal transférase appartient a la famille des polymerases beta (ou pol X).Elle est capable d'élonger un "primer" (amorce) oligonucléotidique long d'au moins 4 bases, à partir des dNTP présents en solution, ajoutés aléatoirement puisque l'enzyme fonctionne sans matrice à recopier. On pense qu'elle est responsable in vivo de la génération de la diversité du système immunitaire a travers l'élongation des régions N a la jonction V(D)J. Le but de cette étude, en collaboration avec l'Unité de Biochimie et de Génétique du Développement (IP), est de caractériser structuralement la spécificité relativement étendue de cette enzyme vis-à-vis de nucléotides triphosphates modifiés et le rôle d'ions métalliques dans le site actif. Des cristaux diffractant a 2.4 Å ont été obtenus et trois dérivés lourds ont été enregistrés, permettant ainsi le calcul d'une carte de densité électronique a 3 Å de résolution. Un modèle comportant plus des trois quarts de la chaîne principale et la moitié des chaînes latérales a été construit et l'affinement des parties manquantes est en cours. Enfin, des cristaux de complexes binaire (TdT + oligonucléotide) et ternaire (TdT + ddNTP + oligonucléotide) ont été enregistrés et montrent de la densité électronique à l'endroit ou on attend les groupes phosphates.

Etude cristallographique des TMP kinases bactériennes (I. Gallay, M. Delarue)

La TMP kinase est une cible potentielle nouvelle pour le design d'antibiotiques. En collaboration avec le Laboratoire de Chimie Structurale des Macromolécules (IP), nous avons cristallisé différentes TMP kinase bactériennes, dont l'une diffracte à 1.9 Å de résolution. Cette forme cristalline a été résolue par remplacement isomorphe et son affinement a été terminée a la fin de l'année dernière. Depuis, nous nous attachons à l'étude cristallographique de différents complexes de cette protéine avec des inhibiteurs qui nous permettra d'affiner la synthèse d'antibiotiques potentiels.

Cristallisation de la protéine non-structurale NSP3 de rotavirus (N. Expert-Besançon, M. Delarue)

La protéine NSP3 de rotavirus a été récemment caractérisée par le groupe de J. Cohen a l'INRA (Jouy-en-Josas); elle est responsable de l'adressage des RNA messagers viraux sur la machinerie de transcription de la cellule hôte. Nous cherchons a cristalliser cette protéine complexée a l'ARN viral, afin de mieux comprendre la nature des interactions mises en jeu. Nous avons récemment réussi a produire de grandes quantités de protéine soluble a 2-3mg/ml, suffisamment pour démarrer des essais de cristallisation.

Biocalorimétrie et thermodynamique structurale (F. Schaeffer)

La station de microcalorimétrie installée l’an dernier dans l'Unité permet une caractérisation thermodynamique complète des réactions biochimiques. Cette caractérisation permet de définir et de décrire en termes énergétiques les forces à l'origine des associations biomoléculaires, et de même, les forces à l'origine de la formation des macromolécules biologiques. Jointe à l'analyse structurale, l’approche thermodynamique permet d'exprimer les grandeurs énergétiques des macromolécules biologiques et de leurs complexes en termes structuraux en tenant compte des caractéristiques du milieu réactionnel. Du point de vu de l’application, la thermodynamique structurale ouvre la voie aux développements de stratégies nouvelles pour le ‘design’ moléculaire basées sur les principes de la thermodynamique. L'analyse thermodynamique des interactions protéine-protéine a été développée cette année à partir de trois exemples différents d’interactions: I, l’association de domaines ‘cohesine-dockerine’ responsable de la formation du complexe cellulolytique, ou cellulosome, produit par la bactérie Clostridium thermocellum (collaboration avec l’Unité de Physiologie Cellulaire). L’analyse thermodynamique a montré que l’association résulte de la supperposition de deux réactions d’associations mutuellement exclusives, d’affinités différentes, et dictées par une force entropique résultant de l’interaction d’une large surface hydrophobe avec le solvent. Cette surface, qui forme le site d’interaction sur la cohésine, est celle impliquée dans la formation de dimères de cohésine à l’état cristallin. II, l’association de la phospholipase A2 secrétée (hsPLA2) et du facteur sanguin Xa (FXa) humains, interaction à l'origine de l'activité anticoagulante de la phospholipase A2 (collaboration avec l’Unité des Venins). L’analyse thermodynamique a montré que l’association résulte d’une force entropique impliquant l’enfouisssement d’une large surface hydrophobe et d’intéractions ioniques impliquant une surface hydrophile restreinte. Ces surfaces d’interaction sont actuellement analysées par mutagenèse dirigée. III, l’association des protéines tyrosine kinase Lck et ZAP-70 impliquées dans l'activation des lymphocytes T (collaboration avec l’Unité d'Immunologie Moléculaire). Le but de l'analyse thermodynamique est la détermination des motifs structuraux de ZAP-70 conférant l'affinité de ZAP-70 pour Lck et la détermination de ligands de haute affinité pour Lck capable d’inhiber cette association in vivo.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

FFEJT, Françoise, IP, ffejt@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

ALZARI, Pedro M., IP
DELARUE, Marc, CNRS
SCHAEFFER, Francis, IP

Stagiaires de l'unité

AMAYA, Maria Fernanda, Thèse
BOITEL, Brigitte, Post-Doc
BUSCHIAZZO, Alejandro, Post-Doc
GALLAY, Inés, Post-Doc
G. GUIMARAES, Beatriz, Post-Doc
HAOUZ, Ahmed, Post-Doc
JOURDAN, Nathalie, Post-Doc
MATE PEREZ, María Jesus, Post-Doc
ORTIZ LOMBARDIA, Miguel, Post-Doc

Autre personnel de l'unité

EXPERT-BESANCON, Nicole, IP
NGUYEN, Tong, IP
SOUCHON, Hélène, CNRS
TELLO, Diana, IP

Publications de l'unité

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