Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Bactériologie moléculaire et médicale pour l'année 1999


Responsable : BARANTON Guy (gbaran@pasteur.fr)

Résumé du rapport

RESUME
La mise au point chez Leptospira d'un vecteur navette permet pour la première fois chez ce genre bactérien d'envisager son étude par l'approche génétique. Chez Borrelia, l'observation que l'invasivité potentielle d'une souche lui soit conférée par un seul géne ouvre aussi un nouveau champ d'études. Chez les Yersinia, l'analyse de déterminants chromosomiques et leur comparaison chez les différentes espèces pathogènes a ouvert une nouvelle voie d'approche vers une meilleure compréhension des mécanismes responsables du pouvoir pathogène exceptionnel de Y. pestis.

Abstract

Abstract

The construction of a shuttle vector for Leptospira allows for the first time to envisage a study of this bacterial genus by a genetic approach. For Borrelia, the observation that the potential invasivity of a strain is conferred by a single gene opens also a new field of investigation. In Yersinia, the study of chromosomal determinants and their comparison among the various pathogenic species has opened a new approach to a better understanding of the mechanisms underlying the exceptional pathogenicity potential of Y. pestis.

Key words: Borrelia, Leptospira, Serpulina, Yersinia, Bacteriology

Texte du rapport

Texte du rapport

L'un des pôles de recherche de l'Unité est l'étude des spirochètes avec une direction fondamentale : aspects structurel et fonctionnel de leur génome, interaction des spirochètes avec leur hôte, et un domaine appliqué : taxonomie, phylogénie et diagnostic. L'autre groupe bactérien exploré est celui des Yersinia dont, là encore, la structure du génome et son degré de stabilité sont analysés. Certains facteurs ou marqueurs de virulence, dont les gènes sont regroupés en un îlot de haute pathogénicité particulièrement instable, sont étudiés. L'épidémiologie moléculaire est également un secteur d'intérêt pour les spirochètes comme pour les Yersinia.

Spirochètes :

Les spirochètes, agents de leptospirose (une anthropozoonose), borréliose de Lyme (transmise par des tiques) et autres spirochétoses sont des bactéries pathogènes à croissance lente. Ces bactéries se prêtent difficilement à l'analyse par la génétique classique car les possibilités de transfert génétique n'étaient jusqu'à présent pas disponibles en routine. La démonstration de la diversité des souches américaines et européennes de B. burgdorferi, alliée aux divers symptômes (dermatologiques, neurologiques et articulaires) a conduit à l'individualisation de nouvelles espèces. L'organisation génomique particulière des spirochètes a été également approfondie: B. burgdorferi a un chromosome linéaire tandis que Leptospira interrogans possède deux chromosomes. Les études des interactions des spirochètes avec leur hôte ont été abordées très récemment.

LEPTOSPIRES

Construction d’un vecteur navette chez les leptospires P. Bourhy, C. Ottone, M. Picardeau, I.Saint Girons Le développement d’outils génétiques chez les leptospires a démarré tout récemment avec la construction d’un vecteur navette Leptospira biflexa-Escherichia coli. Le vecteur est dérivé de l’ADN de l’un des leptobactériophages (LE1) décrits précédemment. Le transfert d’ADN est assuré par électroporation et un marqueur kanamycine d’une bactérie Gram positive est utilisé pour la sélection des transformants. Un fragment de 2,2 kb de LE1 cloné dans un vecteur d’E. coli est suffisant pour assurer la réplication dans une souche de L. biflexa, saprophyte à croissance rapide. Ces résultats nous permettent d’aborder les expériences de génétique reverse chez les leptospires saprophytes et d’espérer réaliser un transfert génétique chez les leptospires pathogènes. Localisation du gène metF sur le chromosome CII de Leptospira interrogans P. Bourhy, I.Saint Girons
Le gène metF de Leptospira interrogans a été isolé du chromosome CII. La séquence déduite en acides aminés est similaire à la methylène tetrahydrofolate reductase d'E. coli (MetF ou MTHFR) et à la partie N-terminale de la MTHFR d’origine humaine. Le gène metF de L. interrogans complémente un mutant metF d’ E. coli, suggérant la fonctionnalité de la branche folate convergeant pour former la méthionine. La localisation des gènes de biosynthèse précoces metX et metY sur le grand chromosome CI (publié précédemment) indique que les gènes méthionine sont dispersés sur les deux chromosomes de Leptospira sp.

Implication indirecte du CD14 dans l’activation des macrophages par le LPS des leptospires C. Werts, I.Saint Girons en collaboration avec R. Ulevitch (USA) Le LPS des leptospires présente peu d'activité endotoxique, activité qui est caractéristique du LPS des bactéries à Gram négatif. L'activation des macrophages et la dépendance vis à vis du CD14 par le LPS des leptospires a été étudié. Les résultats suggèrent que le LPS de leptospire utiliserait, en plus du CD14, un autre récepteur ou un composant permettant la signalisation, différent de celui utilisé par le LPS des bactéries Gram négatives.

Protéines liant la pénicilline chez les Leptospires A. Brenot, I.Saint Girons
La principale thérapie contre la leptospirose consiste en la prescription de pénicilline. Cet antibiotique se lie de façon covalente aux protéines liant la pénicilline (PBP ou "penicillin-binding proteins"), ce qui inhibe leurs activités enzymatiques. Les gènes ponA et pbpB de Leptospira interrogans ont été clonés et séquencés. Ils déterminent respectivement la synthèse de protéines de 82 et 66 kDa similaires à des PBP de bactéries appartenant à différents phyla. Le marquage des PBP de L. interrogans a permis de mettre en évidence 6 PBPs dont deux de 82 et 64 kDa, appelées PBP 1 et PBP 3, correspondant aux gènes ponA et pbpB. Il a été démontré que la protéine PB3, surexprimée, fixe la pénicilline.

Interactions leptospires-cellules-hôtes (F. Mérien)
Après la mise en évidence in vitro de phénomènes d'adhésion, d'invasion des leptospires à l'égard de cellules eucaryotes, puis, in vivo, d'apoptose des hépatocytes, la recherche d' adhésines éventuelles se poursuit : la fibronectine pourrait être un des ligands potentiels. L'étude d'autres facteurs de virulence est aussi prévue notamment concernant des gènes régissant l'acquisition de fer par les leptospires.

Phylogénie des leptospires
(M. Letocart, P. Perolat)
Une étude par Multilocus Enzyme Electrophoresis confirme que le genre Leptospira est organisé en 3 branches dont l'une regroupe les espèces pathogènes strictes (au nombre de 7 jusqu'à présent), une autre les saprophytes (nombre indéterminé, supérieur à 3), et la troisième un groupe dit intermédiaire dont la nature (pathogène ou contaminant) est controversée. Cette étude a, de plus, suggéré que des hétérogénéités dans les collections à travers le monde pourraient être en partie responsable de ces incertitudes. La suite de ce programme inclut la recherche du statut exact (pathogène, saprophyte ou contaminant) des espèces controversées à cet égard (L. meyeri, L. inadai, et L. fainei).

BORRELIA

Des Borrelia chez les oiseaux migrateurs (N. Marti Ras)
En collaboration avec des collègues suédois, il a été montré que les Borrelia isolées dans des colonies d'oiseaux de mer migrateurs, aussi bien chez les oiseaux eux-mêmes que leurs tiques, Ixodes. uriae, appartiennent à une seule espèce, B. garinii. Cependant, le séquençage de trois loci différents montre que ces souches ne semblent pas présenter de spécificité par rapport aux souches isolées de mammifères ou des tiques des mammifères.

Diversité accrue des Borrelia
(D. Postic)
Après la Californie, c'est en Europe qu'ont pu être isolées par des collègues suisses et allemands des Borrelia qui, bien que se rapprochant de Borrelia burgdorferi sensu stricto (B.b.s.s.), en diffèrent à un degré tel qu'elles pourraient bien constituer des espèces génomiques distinctes. Elles apparaissent cependant reliées à leurs équivalentes Californiennes.

Les projets à propos des Borrelia concernent désormais les gènes associés à la virulence. Cette thématique sera abordée d'une part avec un agent des fièvres récurrentes B. turicatae dont les sérotypes soumis à variation antigénique dûe à des recombinaisons de gènes plasmidiques pourraient en partie guider le tropisme d'organe. Simultanément sera entreprise une étude sur Borrelia burgdorferi concernant un gène qui semble à lui seul responsable du determinisme pathogénique éventuel de la souche le portant (infectieuse ou non, pathogène ou non, invasive ou non. Centre National de Référence des Leptospires et Centre Collaborateur OMS/FAO pour l'épidémiologie des leptospires.

http://www.pasteur.fr/clre/

(Danièle Postic, Guy Baranton)

Participation au diagnostic des leptospiroses,recueil et traitement des données épidémiologiques, identification et typage des souches reçues de Metropole, des DOM/TOM et de l'étranger. Diffusion des résultats épidémiologiques. Le résumé du rapport annuel 1998 du CNR concernant la France Métropolitaine et les DOM/TOM, avec les Tableaux chiffrés est disponible sur le serveur Leptospires: http://www.pasteur.fr/Bio/Leptospira/textcnr99

Francisella et Legionella

(Cuong Tram)

Ce laboratoire réalise des expertises pour des collectivités publiques ou privées concernant la recherche de Legionelles dans les systèmes de climatisation et d'adduction d'eau. Ces expertises comportent: isolement par culture,et identification par anticorps monoclonaux et PCR ou hybridation. Pour les Francisella, agents de la tularémie, ce laboratoire fonctionne comme un Centre de référence: détection et isolement des Francisella dans les produits pathologiques humains et animaux. Identification par la mise en évidence des antigènes spécifiques 17 et 43 kd en western blot ou par PCR et hybridation. Les souches de ces 2 genres sont mises en collection après recherche de pénicillinase. D'autres activités de service concernent la fourniture d'antigènes au Centre Pasteur Cerba.

YERSINIA
(Elisabeth Carniel)

Le genre Yersinia comprend trois espèces pathogènes pour l'homme. Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica, largement répandues dans tous les pays tempérés et froids, sont responsables d’une symptomatologie digestive. Y. pestis est l’agent de la peste, maladie qui sévit sous forme endémo-épidémique en Afrique, Asie et Amérique. Le laboratoire des Yersinia étudie les facteurs responsables de la pathogénicité plus ou moins élevée des différentes espèces de Yersinia, les paramètres qui modulent l'expression de ces facteurs et l'organisation du génome de ces bactéries. Notre laboratoire a d'autre part des activités appliquées à la santé publique au niveau national (Centre National de Référence) et international (Centre Collaborateur de l'OMS).

  1. Caractérisation de l'îlot de haute pathogénicité des Yersinia

Depuis quelques années, la notion de régions chromosomiques "étrangères" transférées de manière horizontale par des phages ou des plasmides a émergé. Ces régions qui portent des gènes impliqués dans la virulence ont été appelées "îlots de pathogénicité". Il s'agit de segments d'ADN chromosomique de grande taille, bordés le plus souvent à une extrémité par un locus tRNA et portant des gènes de virulence. Leur capacité d'excision spontanée du chromosome, leur GC% différent de celui du reste du génome et la présence d'une intégrase de type phagique dans certains cas suggèrent qu'ils ont été acquis par l'intermédiaire de bactériophages, par un mécanisme de transfert horizontal. Certaines Yersinia pathogènes hébergent une telle structure, appelée îlot de haute pathogénicité (HPI) car elle leur confère un haut degré de pathogénicité (infections systémiques chez l'homme, létales chez la souris). Notre laboratoire étudie et compare les HPI des trois espèces pathogènes de Yersinia, leur degré d'instabilité, les mécanismes d'excision et leur importance dans la virulence bactérienne.

  1. Caractérisation du locus pgm de 102 kb de Y. pestis (Carmen Buchrieser et Elisabeth Carniel)

L'HPI de Y. pestis se situe sur une région chromosomique instable de 102 kb (locus pgm) bornée à chaque extrémité par une séquence d'insertion IS100. L'analyse après séquençage de l'intégralité de ce fragment et des régions chromosomiques adjacentes a été effectuée en collaboration avec le laboratoire de Génomique des Microorganismes Pathogènes et A. Billault du Centre d'Études du Polymorphisme Humain (CEPH). 83 phases de lecture potentiellement codantes ont été identifiées sur l'insert de 119 kb contenu dans un clone BAC (Bacterial Artificial Chromosome). La présence aux extrémités de l'îlot de 3 séquences phagiques suggère que cet élément à été acquis en bloc par l'intermédiaire d'un phage. Cet îlot porte de plus les déterminants (intégrase, courtes séquences répétées bornantes) pouvant permettre son excision par un mécanisme de recombinaison site spécifique. Le reste du fragment instable porte des séquences codantes homologues à des gènes impliqués dans l'utilisation de différents acides aminés, des gènes régulateurs ou des systèmes de transport trans-membranaires. Deux opérons peuvent potentiellement jouer un rôle dans la virulence de Y. pestis (fimbriae F17-like et système de régulation à deux composants bvgA/bvgS). Curieusement, plusieurs gènes ne sont pas fonctionnels suite à leur interruption par des séquences d'insertion ou à des mutations ponctuelles spécifiques de l'espèce Y. pestis.

b. Analyse de la stabilité de l'HPI de Y. enterocolitica (S. Bach, C. Buchrieser, A. Guiyoule et E. Carniel)

Alors que l'HPI de Y. pseudotuberculosis est capable de s'exciser précisément du chromosome avec une fréquence élevée, l'îlot de Y. enterocolitica semble très stable, aussi bien parmi des isolats naturels qu'après multiples repiquages in vitro. Pour tenter d'obtenir des souches de Y. enterocolitica délétées de l'îlot nous avons utilisé une stratégie de sélection positive basée sur le fait que le gène fyuA porté par l'HPI est à la fois le récepteur de la yersiniabactine et de la bactériocine pesticine. Trois clones délétants indépendants ont été obtenus avec une fréquence d'environ 5x10-7. La délétion, identique chez les trois clones, ne se limite pas aux 45 kb de l'HPI mais emporte un segment chromosomique d'environ 140 kb. Les mutants ont perdu non seulement la capacité à synthétiser la yersiniabactine mais aussi leur mobilité à 28°C, l'hydrolyse de l'ONPG et l'activité Tween-estérase. Dans le modèle murin expérimental, la virulence de ces mutants injectés par voie intraveineuse est >7x103 fois inférieure à celle de la souche sauvage. L'analyse de la machinerie d'excision site spécifique de l'HPI de Y. enterocolitica a mis en évidence l'existence d'un gène int très proche de celui des deux autres espèces mais interrompu par un codon stop prématuré et la dégénérescence d'une des séquences répétées de 17 pb bornant l'HPI. L'absence d'une intégrase fonctionnelle et de sites att-like conservés peut donc expliquer l'incapacité de l'HPI de Y. enterocolitica à s'exciser de façon précise. Ce phénomène pourrait représenter une étape de fixation d'un élément auparavant mobile dans le génome de cette espèce.

2. Origine récente de l'espèce Y. pestis (G. Torrea, A. Guiyoule et E. Carniel)

En collaboration avec l'équipe du Dr. Achtman du Max Planck Institute à Berlin, nous avons entrepris l'analyse de l'évolution des Yersinia pathogènes en étudiant leur polymorphisme génétique par MLST (Multi Locus Sequence Typing). Pour cela, des portions de 6 gènes métaboliques ont été séquencées chez 36 souches de Y. pestis, 12 souches de Y. pseudotuberculosis et 13 souches de Y. enterocolitica de différents biotypes, sérotypes, ribotypes, hôtes et origines géographiques. L'ensemble des régions séquencées s'est révélée être absolument identique pour tous les gènes étudiés chez toutes les souches de Y. pestis (ce qui correspond à 21881 sites synonymes identiques). La comparaison de ces régions chez les trois espèces suggère que l'ancêtre commun des Yersinia est apparu il y a 42 à 187 millions d'année et que Y. pestis est une espèce très récente, ayant émergé de Y. pseudotuberculosis il y a seulement 1 500 à 20 000 ans. L'analyse de la microévolution de l'espèce Y. pestis effectuée en étudiant le polymorphisme de distribution génomique de la séquence d'insertion IS100 démontre une corrélation parfaite entre la distribution de cette IS et le biovar des isolats. L'arbre phylogénétique obtenu renforce l'hypothèse selon laquelle chacune des trois pandémies historiques de peste a été causé par un biovar spécifique de Y. pestis.

3. Identification et caractérisation de la thymidilate kinase de Yersinia pestis (V. Chenal-Francisque et E. Carniel)

La thymidylate kinase (TMPK) une nucléoside monophosphate kinase mal caractérisée chez les bactéries, qui représente une étape limitante dans la synthèse du dTTP à partir de la thymidine ou du dUTP. C'est la monophosphate kinase la moins représentée dans la cellule bactérienne. En collaboration avec l'équipe de O. Barzu (Laboratoire de Chimie Structurale des Macromolécules), nous avons entrepris la caractérisation génétique et biochimique de la TMPK de Y. pestis. Le clonage et le séquençage du gène tmk a montré qu'il était bien conservé au sein des espèces Y. pestis et Y. pseudotuberculosis mais moins bien conservé chez les autres espèces de ce genre bactérien. L'étude biochimique et physico-chimique de la protéine TMPK recombinante de Y. pestis surexprimée chez E. coli montre qu'elle est structurellement et biochimiquement proche de la protéine native de E. coli. Cependant, malgré les fortes similarités des séquences protéiques et nucléotidiques, la TMPK de Y. pestis possèdent certaines caractéristiques thermodynamiques et catalytiques particulières: elle est moins thermostable et est plus sensible à la dénaturation par l'urée et par un environnement acide. La différence la plus marquante concerne la capacité à utiliser l'AZTMP comme substrat: celle-ci est beaucoup plus importante chez E. coli que chez Y. pestis alors que les domaines catalytiques de ces enzymes sont presque identiques. Ces résultats indiquent que l'AZT ne peut être utilisé comme agent antibactérien contre Y. pestis et permettent de comprendre les raisons de cette inefficacité.

4. Test d'identification de la ß-lactamase de type A de Y. enterocolitica. (L. Martin et E. Carniel)

Les Y. enterocolitica possèdent deux béta-lactamases chromosomiques: l'enzyme A (pénicillinase) et l'enzyme B (céphalosporinase) qui rendent les souches naturellement résistantes à l'action des pénicillines et des céphalosporines de 1ère génération. L'enzyme A des Yersinia se différencie de celle des autres enzymes bactériennes du même type par sa très grande susceptibilité à l'action de l'acide clavulanique. En collaboration avec le Dr. J. Pham (Prince of Wales Hospital, Sydney, Australie) nous avons développé un test de diffusion en disque basé sur la résistance de Y. enterocolitica à la ticarcilline conférée par l'enzyme A et à la forte inhibition de cette enzyme par l'acide clavulanique. Ce test permet de différencier très simplement l'enzyme A des Yersinia des autres enzymes bactériennes. Il permet également la distinction des Y. enterocolitica du biotype 2 et du sérotype O:5,27 des autres Y. enterocolitica et peut être utilisé comme test de screening à partir d'échantillons biologiques.

5. Centre National de Référence des Yersinia.

L’activité du CNR des Yersinia porte sur la caractérisation de souches, principalement d’origine humaine. Le centre a de plus des activités de recherche appliquées à l'épidémiologie, à la thérapeutique et au diagnostic clinique. Il participe à la description de formes cliniques inhabituelles de yersinioses et à l'élaboration de nouvelles techniques de diagnostic biologique. Nos travaux servent au développement de nouvelles méthodes de diagnostic et de marquage épidémiologique, à la lutte contre certaines formes particulières de yersinioses, à l'amélioration de la taxonomie du genre Yersinia, et d'un point de vue plus fondamental, à une meilleure connaissance des facteurs et des mécanismes responsables de la pathogénicité de ces bactéries.

6. Centre Collaborateur de l'OMS

L’activité du centre collaborateur OMS de Référence et de Recherche pour les Yersinia porte sur le typage des souches isolées du monde entier, la conservation de ces souches, la fourniture de matériel biologique, de protocoles, de conseils pratiques ou de références bibliographiques, la formation de stagiaires étrangers, et la formulation de recommandations. Le centre a de plus une activité d'expertise de souches atypiques et participe à des missions sur le terrain.

7. Programme de séquençage du génome de Y. pseudotuberculosis

Le génome de Y. pestis a été très récemment séquencé par le Sanger Centre. Cette séquence devrait être prochainement complètement assemblée puis annotée. Il est peu probable que les facteurs responsables de la pathogénicité exceptionnelle de Y. pestis puissent être identifiés et compris à partir de la simple analyse de cette séquence. Une analyse comparative du génome de Y. pestis et de Y. pseudotuberculosis (bactérie génétiquement très proche de Y. pestis mais de virulence bien moindre) pourrait aider à l'identification de gènes qui différencient ces deux espèces au niveau de leur pouvoir pathogène. Une collaboration entre le Lawrence Livermore National Laboratory (LLNL) aux États-Unis et notre laboratoire a été établie pour le séquençage du génome de Y. pseudotuberculosis. La partie séquençage proprement dite a récemment débuté au LLNL. Le travail de notre laboratoire porte sur la partie pré-séquençage (purification de clones BAC, établissement d'une banque ordonnée, fourniture d'ADN génomique) et post-séquençage (analyse des différences entre les séquences de Y. pestis et de Y. pseudotuberculosis, distribution de ces allèles au sein de chaque espèce, analyse du rôle de ces régions variables sur la pathogénicité par mutagénèse réverse et étude du pouvoir pathogène expérimental dans le modèle murin).

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

DELARUE Nadine, IP
DUVAQUIER Annie, IP

Chercheurs de l'unité

CARNIEL Elisabeth, IP, carniel2@pasteur.fr, GUINET Françoise, IP, fguinet@pasteur.fr, POSTIC Danièle, IP, dpostic@pasteur.fr
SAINT GIRONS Isabelle, IP, isgirons@pasteur.fr, WERTS Catherine, IP, cwerts@pasteur.fr

Stagiaires de l'unité

BACH Sandrine, Thèse
BELAID Djilali, DEA
BRENOT Audrey, Thèse
CHARAVAY Françoise, Technicienne
MARTI RAS Nuria, Thèse
PIERRE Fabrice, Scientifique du Contingent ROSSO Marie-Laure, Post-doc
TURK Nenad, Post-doc
VAN DEN HAUTE Bernard, DEA

Autre personnel de l'unité

BELLENGER Elisabeth, IP
BOURHY Pascale, IP
CHENAL Viviane, IP
FOULON Jeannine, IP
GUIYOULE Annie, IP
FOURNIE-AMAZOUZ Edith, IP
MARTIN Liliane, IP
OTTONE Catherine, IP
SERTOUR Natacha, IP
TRAM Cuong, IP

Publications de l'unité

En cas de problèmes ou de remarques concernant ce serveur Web, écrire à rescom@pasteur.fr. Cette page a été modifiée pour la dernière fois le Mercredi 26 Avril 2000 à 12 h 42 (Temps Universel) .