Rapport d'activité de l'unité Biochimie microbienne pour l'année 1999

CNRS URA 2172

Responsable : RAPOPORT Georges (rapoport@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Les travaux poursuivis par l'Unité de Biochimie Microbienne concernent la régulation de l'expression génétique chez les bactéries Gram-positives : Bacillus (B. subtilis, B. thuringiensis) et Streptomyces. Les travaux réalisés ont porté sur le métabolisme de sources de carbone et d'azote, la transduction de signaux et du stress au cours de la phase stationnaire chez B. subtilis, la production de toxines entomopathogènes et d'autres facteurs de virulence chez B. thuringiensis et la réponse au choc thermique chez les Streptomyces. Ces recherches ont été étendues récemment à l'analyse de la réponse aux stress et aux facteurs de virulence chez d'autres bactéries Gram-positives pathogènes : Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae.

Abstract

The major theme of the Unit is the study of the regulation of gene expression in Gram-positive bacteria : Bacillus (B. subtilis, B. thuringiensis) and Streptomyces. Research topics include metabolism of carbon and nitrogen sources, signal transduction and stress during the stationary phase in B. subtilis, expression of insecticidal protein toxins and other virulence factors in B. thuringiensis and related bacteria and the heat shock response in Streptomyces. This work has been recently extented to the study of stress responses and virulence factors in several Gram-positive pathogens : Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae.

Texte du rapport

1. Etude du régulon sigL de Bacillus subtilis (Naïma Ould Ali, Tarek Msadek, Maryvonne Arnaud, Michel Débarbouillé). Chez B. subtilis, le gène sigL code pour un facteur sigma homologue de sigma 54 des bactéries Gram-négatives. Sigma L est requis pour l'utilisation d'amino-acides comme sources d'azote (arginine, ornithine, isoleucine et valine) et pour l'utilisation de certaines sources de carbone telles que fructose ou l'acétoïne. Nous avons identifié certains des gènes régulateurs spécifiques contrôlant positivement l'expression des opérons du régulon sigL. Ces régulateurs stimulent la transcription en se fixant sur des séquences appelées " Activating Sequences " AS, localisées à distance des promoteurs régulés soit en amont (UAS), soit en aval (DAS) des promoteurs -12, -24. Ainsi, la protéine RocR stimule la transcription de deux opérons, rocABC et rocDEF, ainsi que celle du gène rocG intervenant dans le catabolisme de l'arginine. Nous avons purifié la protéine RocR et pu montrer que cette protéine interagit sur l'ADN au niveau de deux séquences présentes entre la fin du gène rocG (DAS) et le début de l'opéron rocABC (UAS). Ces deux séquences avaient été précédemment identifiées par des expériences de délétion. Nous avons introduit des mutations ponctuelles dans les séquences AS et pu montrer que ces mutations affectent la transcription à la fois de rocG et rocABC. Le mécanisme moléculaire par lequel RocR fixé sur cette séquence active la transcription de rocG et rocABC est à l'étude. Le second opéron sigL-dépendant étudié est l'opéron acoABCL impliqué dans le catabolisme de l'acétoïne. L'acétoïne est un produit de fermentation majeur sécrété par de nombreuses bactéries cultivées en excès de glucose. Lorsque le glucose est épuisé, l'acétoïne est utilisé comme source d'énergie. Nous avons entrepris l'étude de la transcription de l'opéron acoABCL. Nous avons montré qu'il est induit par l'acétoïne. Son expression est fortement réprimée par la présence de glucose dans le milieu de culture via la protéine CcpA (régulateur transcriptionnel impliqué dans la répression catabolique chez B. subtilis). Les expériences d'extension d'amorce ont permis de déterminer le +1 de transcription de l'opéron acoABCL. L'analyse de la séquence d'ADN en amont du promoteur a révélé la présence d'une séquence CRE potentielle (séquence cible de CcpA). L'effet de mutations au niveau de cette séquence sur la répression de acoABCL par CcpA est en cours d'étude. Nous avons également montré que le gène acoR localisé en aval de l'opéron acoABCL, est le gène régulateur. De plus, le produit de ce gène présente des similitudes avec les régulateurs à domaine central. Le gène acoR ne fait pas partie de l'opéron qu'il régule, mais est également soumis à la répression catabolique par le glucose. Par des délétions progressives au niveau de la région d'ADN en amont de acoABCL, nous avons déterminé des séquences cibles potentielles de AcoR. La purification de AcoR est en cours et des expériences de retard sur gel et d'empreinte à la DNase I sont envisagées pour l'étude de l'interaction de AcoR avec l'ADN.

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   2. Réponse à l'environnement chez Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus et Listeria monocytogenes (Tarek Msadek, Isabelle Derré, Arnaud Chastanet).

Nous avions montré que les gènes de choc thermique codant pour les sous-unités de la protéase ATP-dépendante Clp chez Bacillus subtilis sont contrôlés par le répresseur CtsR. Une étude structure/fonction du régulateur CtsR de B. subtilis a été réalisée, permettant de définir plusieurs domaines fonctionnels dans la protéine. Des expériences de pontage chimique réalisées en incubant la protéine purifiée CtsR avec le glutaraldéhyde ont permis de montrer que CtsR se dimérise. La construction de plusieurs fusions de gènes entre ctsR et le gène du répresseur CI de lambda de E. coli indique que la partie amino-terminale de CtsR serait nécessaire à sa dimérisation, plus particulièrement les 25 premiers acides aminés. Plusieurs mutations ont été isolées, modifiant des résidus au niveau du domaine de liaison à l'ADN de type hélice-tour-hélice et conduisant à une expression constitutive des gènes du régulon CtsR. Plusieurs de ces protéines CtsR modifiées ont été purifiées, et leur incapacité de se fixer à l'ADN a été montrée in vitro. La forme active de CtsR est la forme dimérique, puisque des expériences de co-expression in vivo du gène ctsR et de tels allèles mutants indiquent que ces mutations présentent un phénotype négatif dominant, suggérant la formation d'hétérodimères inactifs de CtsR. Nous avons montré que le gène clpP de Streptococcus salivarius, les opérons dnaK et groESL de S. aureus et l'opéron groESL de S. pneumoniae ont des cibles localisées en tandem pour les répresseurs HrcA et CtsR, suggérant une double régulation par ces deux répresseurs. Ce sont les premiers exemples de gènes de réponse aux stress avec une régulation de ce type. Des fusions de transcription avec les gènes clpP et clpC de S. pneumoniae ont été construites avec le gène bgaB, codant pour une beta-galactosidase thermostable. Le gène ctsR de S. pneumoniae a par ailleurs été cloné sous le contrôle d'un promoteur inductible par le xylose, pxylA. En combinant ces constructions placées en monocopie dans le chromosome d'un mutant *ctsR de B. subtilis, une régulation par CtsR de S. pneumoniae et par le choc thermique a été démontrée in vivo. La protéine CtsR de S. pneumoniae a été purifiée et des expériences de retard de migration sur gel et d'empreinte à la DNase I ont permis de montrer sa fixation sur les régions régulatrices des gènes clpP et clpC. Pour S. aureus, une régulation par CtsR in vivo a été démontrée de façon analogue pour les gènes clpC, clpP et clpB. Pour les opérons dnaK et groESL, les gènes ctsR et hrcA de S. aureus ont été clonés soit séparément, soit en opéron synthétique, derrière le promoteur inductible pxylA et une double régulation par CtsR et HrcA de S. aureus a été démontrée in vivo. Nous avons étudié la régulation par CtsR des gènes clp de Listeria monocytogenes en collaboration avec le laboratoire de Patrick Berche (Faculté de Médecine, Necker Enfants Malades, Paris). Un mutant d'inactivation du gène ctsR de L. monocytogenes a été construit, montrant une résistance accrue aux conditions de stress (croissance en présence de 2 % NaCl ou à 42° C) qui peut être attribuée à une augmentation du taux de synthèse des protéines. Le rôle du régulateur CtsR dans la virulence a été testé dans le modèle murin. Lorsque le gène ctsR est placé chez L. monocytogenes sur un plasmide multicopies, la DL50 est augmentée de façon significative, vraisemblablement suite à la répression de l'expression des gènes clp.

3. Etude de la virulence de Bacillus thuringiensis (Didier Lereclus, Hervé Agaisse, Myriam Gominet, Sylvie Salamitou). Les recherches portant sur l'expression des gènes de virulence de Bacillus thuringiensis ont conduit à caractériser un activateur transcriptionnel qui contrôle l'expression d'au moins quinze gènes codant pour des protéines exportées. Il s'agit de phospholipases, de protéases, d'entérotoxines et de protéines de paroi. Cet activateur transcriptionnel, PlcR, a donc un effet pléiotrope sur l'expression de plusieurs gènes potentiellement impliqués dans la virulence. Dans tous les cas, la région promotrice de ces gènes comporte une courte séquence palindromique conservée qui est la cible reconnue par PlcR. Le gène plcR a été trouvé chez les différentes espèces bactériennes appartenant au groupe Bacillus cereus. Cependant, chez B. anthracis, plcR est présent sous une forme tronquée inactive. Une mutagénèse insertionnelle avec Tn10 nous a permis d'identifier plusieurs gènes impliqués dans la régulation de plcR ; leur caractérisation est en cours. Le gène plcR a été interrompu chez B. thuringiensis de façon à évaluer son rôle dans la virulence. Les résultats obtenus indiquent que la délétion de plcR abolit l'effet synergique des spores sur l'activité insecticide des cristaux. De plus, des essais d'infection réalisés chez la souris (par instillation nasale) montrent que l'inactivation du gène plcR réduit fortement la virulence de B. thuringiensis et de B. cereus. L'ensemble de ces données suggèrent donc que le régulon plcR joue un rôle majeur dans le pouvoir pathogène de bactéries opportunistes comme B. thuringiensis et B. cereus.

4. Caractérisation et étude de la régulation de l’expression de toxines insecticides sécrétées par Bacillus thuringiensis (Sylvain Espinasse, Didier Lereclus et Vincent Sanchis). En 1999, un nouveau programme concernant la recherche de nouvelles molécules toxiques produites par Bt a été mis en place en collaboration avec l’Unité de Recherches de Lutte Biologique de l’INRA de La Minière. L’analyse de la toxicité, sur plusieurs insectes, des surnageants de culture provenant d’un échantillon de 50 souches de Bt a révélé que l’une des souches, 407-pig+, était capable de sécréter un facteur toxique possédant une très bonne activité contre deux ravageurs agricoles importants : Anthonomus grandis et Aphis craccivora. Outre le fait que son surnageant possède un très forte activité insecticide, cette souche présente la caractéristique de produire un pigment brun. Le composé responsable de l’activité de la souche 407-pig+ a été purifié et identifié par M. Gohar à l’INRA ; il s’agit de la beta-exotoxine, un composé de nature non protéique qui inhibe l'activité de l'ARN polymérase en se substituant à l'ATP. Les niveaux de production de ce composé par la souche 407-pig+ sont très élevés (> 100 µg/ml). Une expérience de mutagénèse par transposition à l’aide d’un mini-Tn10 a été réalisée et un mutant affecté simultanément dans la production de pigment et la sécrétion du composé toxique a été obtenu. Le transposon s’est inséré dans un gène codant pour une protéine présentant des similitudes avec les protéines de la famille des ABC-transporteurs. La similitude avec la protéine fixant l’ATP s’étend sur plus de 200 résidus incluant les deux motifs de Walker A et B, communs entre les domaines de fixation de l’ATP des protéines ABC. Le deuxième gène de l’operon, code pour une protéine présentant des similitudes avec une oligopeptide perméase qui pourrait correspondre au domaine membranaire du transporteur ABC et qui est généralement impliqué dans le transport du substrat et sa spécificité. En aval de ces deux gènes se trouve un second opéron de trois gènes dont le premier gène code pour une protéine présentant des similitudes avec les facteurs sigma W, Y, V et X de Bacillus subtilis. Ces facteurs appartiennent à une sous-famille de type ECF (extracytoplasmic function) qui interviennent dans l’assimilation ou la sécrétion de molécules en réponse à différents stress extracellulaires. L’interruption du gène codant pour cette protéine dans la souche 407-pig+ conduit à un phénotype avirulent ; par ailleurs, le dosage de beta-exotoxine dans le surnageant de culture de cette souche révèle que cette molécule n’est plus produite et/ou sécrétée. L’étude du facteur sigma et du transporteur ABC putatifs ainsi que de leur implications respectives dans l’export et/ou la régulation de la synthèse ou de la sécrétion de la beta-exotoxine se poursuit actuellement.

5 Etude de la réponse aux stress chez les Streptomyces (Philippe Mazodier, Pascale Servant, André Sobczyk, Julie Viala). Les Streptomyces sont des bactéries filamenteuses sporulantes du sol qui produisent plus de la moitié des 10 000 antibiotiques connus. Nous étudions la réponse adaptative aux stress, car celle-ci intervient au cours du cycle de différenciation morphologique et physiologique des Streptomyces. Nous avons montré qu'il existe de nombreuses familles de chaperons paralogues impliqués dans la réponse aux stress (2 groEL, 2 dnaJ, 2 clpC, etc...) et de nombreux modes de régulation. Nous avons cloné et caractérisé trois répresseurs dont deux originaux : HspR, le répresseur de l'opéron dnaK ainsi que du gène clpB et RheA, le répresseur du gène hsp18. Nous avons mis en évidence un changement de conformation thermodépendant de RheA. Cette transition réversible permet à RheA de jouer le rôle de thermomètre moléculaire dans la cellule et d'assurer la régulation de l'expression de hsp18. Cette multiplicité de gènes et de contrôles doit permettre la parfaite adaptation des Streptomyces à tous les stress créés par les variations de leur environnement, le sol. En contrôlant la synthèse des chaperons DnaK, ClpB, GroES/EL, Hsp18, nous cherchons à construire une souche de S. lividans optimisée pour l'expression de protéines hétérologues ayant un intérêt industriel. Par ailleurs, nous avons montré que le complexe protéolytique ClpP/ClpX était impliqué dans la régulation de la différenciation morphologique et physiologique des Streptomyces. En effet, un mutant clpP1 est incapable de se différencier, il possède un phénotype " bald " défini par l'incapacité de former un mycélium aérien. Une surexpression des gènes clpP1/clpP2 et/ou clpX accélère la différenciation et la production de certains antibiotiques. Nous avons montré que les gènes paralogues clpP3 et clpP4 sont exprimés lors de l'interruption de clpP1. Nous avons caractérisé le gène popR qui code pour le régulateur de l'opéron clpP3/clpP4. PopR est un activateur qui n'est actif que dans un mutant clpP1. Le maintien de phénotype " bald " dans ce mutant lors de l'expression de clpP3/clpP4 suggère que les diverses protéines ClpP ne sont pas iso-fonctionnelles mais ont des spécificités d'action différentes. La connaissance du contrôle du cycle de différenciation des Streptomyces présente un grand intérêt pour l'exploitation de ces microorganismes en biotechnologie.

Mots-clés
Bacillus, Streptomyces, Streptocoques, Staphylocoques, métabolisme carboné et azoté, transduction de signaux, stress, toxines entomopathogènes, antibiotiques.

Lien
http://www.pasteur.fr/Bio/SubtiList

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

CHAUVIN Ninon, IP
DUGAST Christine, IP

Chercheurs de l'unité

DEBARBOUILLE Michel, DR CNRS
KLIER André, Pr Université Paris 7
LERECLUS Didier, DR INRA
MAZODIER Philippe, CL IP
MSADEK Tarek, CR IP
RAPOPORT Georges, DR CNRS, Pr IP
SALAMITOU Sylvie, CR CNRS
SANCHIS Vincent, CR INRA

Stagiaires de l'unité

CHASTANET Arnaud, DEA
DERRE Isabelle, Thèse
FOURNIER Bénédicte, Post-doc
GRANDVALET Cosette, ATER Paris 7
OULD ALI Naïma, Thèse
ROBICHON Denis, Post-doc.
SERVANT Pascale, post-doc
SOBCZYK André, Post-doc.
VIALA Julie, Thèse

Autre personnel de l'unité

ARNAUD Maryvonne, Ingénieur IP
BIGNON-TOPALOVIC Joëlle, Technicienne IP GOMINET Myriam, Technicienne IP

Publications de l'unité