Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Biologie moléculaire du Gène pour l'année 1999

U.277 INSERM


Responsable : KOURILSKY Philippe (caput@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L’Unité de Biologie Moléculaire du Gène a poursuivi une recherche largement dominée par l’identification et le répertoire des lymphocytes T. Une partie des travaux a permis de définir le nombre et la taille des clones T naifs et mémoire qui circulent dans le sang. D’autres ont visé à caractériser les lymphocytes T qui participent à des phénomènes physiopathologiques chez l’homme et la souris, de la réponse aux infections aux affections cancéreuses. Une étude sur les mécanismes moléculaires de la mémoire immunitaire a été lancée en 1999.

Abstract

The work carried out in the Unité de Biologie Moléculaire du Gène is largely focused on the characterization and the repertoire of T cells. The size of naive and memory T cell clones was determined. The description of the specific T lymphocytes involved in a variety of physiopathological conditions in man and mouse, ranging from the response to infectious agents to the response to cancer cells, has been continued. A study on the molecular mechanisms of immunological memory has recently been launched.

Texte du rapport

Thème 1 – Analyse des réponses T antitumorales. Suivi de protocoes d’immunointervention. Responsable : Laurent Ferradini

Le projet du groupe d’immunologie des tumeurs présente deux axes de recherche. Le premier concerne l’analyse de réponses antitumorales T chez la souris avec la mise en place d’un modèle de mélanome inductible in vivo afin d’étudier la réponse antitumorale dans une situation la plus physiologique possible. Le deuxième axe concerne l’analyse de la réponse antitumorale au cours du mélanome chez l’homme en se concentrant sur l’analyse des réponses T CD4+ grâce à l’utilisation de tétramères MHC de classe II, sur l’analyse des cellules T mémoires, et sur le suivi immunologique des réponses T chez des patients traités par immunothérapie.

Thème 2 : Réponse immunitaire aux glycolipides bactériens. Responsable : Gabriel Gachelin

L’étude du rôle des cellules NKT dans la réponse granulomateuse de la souris C57BL/6 à l’injection de glycolipides d’origine mycobactérienne, a été poursuivie. Il a été démontré que cette réponse était purement de type TH1 tant au plan de la sécrétion locale de cytokines qu’à celui du profil des récepteurs de chémokines exprimés par les lymphocytes du granulome. L’étude des chaines polypeptidiques du TCR des cellules NKT isolées de plusieurs organes a été réalisée par analyse de la diversité en taille des régions de reconnaissance des chaînes a et b, puis en déterminant un grand nombre de séquences nucléotidiques des régions de diversité. Cette analyse a permis de conclure au caractère dominant de la chaîne alpha du TCR dans la sélection des cellules NKT CD1d-restreintes. En pathologie humaine, le groupe a poursuivi ses études sur les lymphocytes infiltrant les lésions cutanées humaines, en collaboration avec une équipe de l’Hôpital Saint Louis. En particulier les cellules NKT ont été retrouvées dans les lésions cutanées de la lèpre, mais pas dans les lésions histologiquement voisines des formes cutanées de la sarcoïdose, ce qui exclut le rôle de mycobactéries atypiques dans cette dernière maladie. La technique de l’Immunoscope a été adaptée à la détermination quantitative des cellules tumorales dans le sang et les lésions du lymphome de Sezary, afin d’évaluer l’efficacité de différents traitements. Enfin, une petite partie du groupe a poursuivi une étude sur les origines du système immunitaire en précisant les relations phylogénétiques des poissons sans machoires et dépourvus de système immunitaire adaptatif.

Thème 3 : Les lymphocytes T des muqueuses Responsable : Delphine Guy-Grand

  1. Nous avons étudié le répertoire des lymphocytes de la muqueuse intestinale, CD4 et CD8b et celui des cellules à division rapide circulant dans la lymphe du canal thoracique . Nous avons pu démontrer que ces différentes populations partageaient un répertoire oligoclonal identique et étaient liées par une communauté d’origine. (Publication : T . Arstila et al JEM)
  2. Nous avons montré, grâce à l’addition retardée de molécules costimulatrices dans un système d’activation des cellules T CD8+, que les signaux d’activation et de costimulation ne doivent pas être nécessairement délivrés de façon simultanée et colocalisée pour que la costimulation soit effective. (Publication : Pardigon et al. J. Immunol)

Dans l’année à venir, nous comptons porter nos recherches 1) sur l’origine, les étapes de différenciation et de maturation des lymphocytes T dits thymo-indépendants, logés dans l’épithélium de l’intestin. 2) sur les conséquences de la costimulation des lymphocytes CD8+ sur la différenciation en cellules effectrices et à mémoire, migrant soit dans les organes lymphoïdes, soit dans le poumon et l’intestin.

Thème 4 – Etude des répertoires de lymphocytes T murins et de leur sélection dans le thymus et la périphérie. Responsable : Jean Kanellopoulos.

Les travaux de notre laboratoire sont centrés sur les études de répertoire des lymphocytes T chez les souris normales ou déficientes et sur le rôle des cellules thymiques nourricières (TNC) dans l’éducation thymique. Nous avons développé une technique Immunoscope de deuxième génération qui a permis d'obtenir des informations sur le nombre et les caractéristiques de séquences distinctes contenues dans un pic de CDR3 de taille donnée. Nous avons déterminé que la taille du répertoire des splénocytes normaux de souris était d'au moins 2 x 106 TcR distincts et que celle des lymphocytes T du sang humain était de 2 x 107. Nous avons utilisé cette méthode pour étudier le répertoire T des souris invalidées pour le gène de la didéoxynucléotidyl transferase terminale ou pour les gènes polymorphes H-2K et H-2D du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). Nos travaux en cours portent sur la sélection des répertoires des lymphocytes T par un seul complexe peptide/molécule de classe I du CMH. Grâce à la méthode appelée "Representational Difference Analysis", nous identifions le ou les gènes spécifiques des TNC afin d'élucider la ou les fonctions de ces cellules impliquées dans l'éducation des thymocytes. Enfin, en collaboration avec David Ocjius de l'Institut Pasteur, nous avons entamé un projet transversal qui permet d'appliquer nos compétences en immunologie fondamentale à un problème de santé publique, l'infestation par le parasite Cryptosporidium Parvum.

Thème 5 :- Analyse des populations de lymphocytes T mémoire et effectrices et étude des bases moléculaires de leur phénotype. Responsable : Philippe Kourilsky

L’Unité a complété sa panoplie d’outils nécessaires à l’étude des répertoires des lymphocytes T. Ainsi, l’Immunoscope II permet-il d’étudier la diversité au niveau des séquences des réarrangements des gènes de TcR. Couplé aux techniques de tri des lymphocytes T à l’aide de multimères CMH-peptide, cet outil a déjà permis d’analyser ces répertoires dans diverses situations physio-pathologiques. Intégrés dans une plateforme, ces technologies nous permettront de participer au suivi d’essais cliniques d’immunointervention. Cette équipe a également débuté une étude visant à caractériser les modifications épigénétiques survenant au cours de la différenciation des lymphocytes T en cellules effectrices ou mémoire. La méthode RLGS-M est utilisée pour localiser ces modifications. L’objectif ultime est de comprendre les mécanismes moléculaires conduisant à la mémorisation immunitaire.

Thème 1 – Analysis of antitumor T cell responses. Follow-up of imunotherapeutic protocols. Responsable : Laurent Ferradini

The project of our group working on tumor immunology has two main orientations. The first one consists in the analysis of antitumoral T cell responses in mice using an in vivo inducible model of melanoma to study the response in a situation as physiological as possible. The second orientation consists in the analysis of the antitumoral response in melanoma patients focusing on the CD4+ T cell response based on the use of MHC classe II tetramers, on the analysis of memory T cells, and on the immunological follow-up of the T-cell response in patients treated by immunotherapy.

Thème 2 : Immune response to bacterial glycolipids. Responsable : Gabriel Gachelin

The role of NKT cells in the granulomatous réaction induced in C57BL/6 mice by the sub-cutaneous injection of mycobacterial glycolipids has been studied. The response is on the TH1 side both on the nature of the secreted cytokins and of the receptors of chemokins expressed by the locally attracted lymphocytes. The diversity of the a and b chains of the TCR of NKT cells has been studied in details both by determining the size diversity of the recognition region of the b chains associated to the invariant a chain, and by carrying out an extensive survey of the molecular structure of that region. It could be concluded that the invariant a chain plays a predominant role in the recognition of the restricting element of NKT cells, namely the CD1d molecules. Studies on the identification of the T cells, which infiltrate the human skin in various pathological processes, have been continued, in collaboration with a group of Saint-Louis hospital in Paris. It was shown that NKT cells infiltrate the granulomatous lesions due du Mycobacterium leprae. By contrast, the histologically identical lesions of sarcoidosis did not contain NKT cells but rather T cells undergoing local proliferation on some unidentified antigen. The role of mycobacteria in sarcoidosis was ruled out. The Immunoscope analysis has been adapted to the quantification of tumor cells in the Sezary’s lymphoma in order to monitor the efficiency of different therapeutical approaches. Finally a small part of the group working on the origin of the adaptative immune system has concluded a phylogenetic analysis aimed at determining the relationships between jawless vertebrates which lack an adaptative immune system.

Thème 3 : Mucosal T lymphocytes
Responsable : Delphine Guy-Grand

  1. We studied the repertoire of the gut mucosal lymphocytes (CD4 and CD8) as well as that of the newly dividing cells circulating in the thoracic duct lymph. We demonstrated that both populations shared an identical oligoclonal repertoire, and thus had a related origin. (T. Arstila et al, JEM)
  2. We showed through the delayed addition of costimulatory molecules in CD8 T cell activation system that activation and costimulation signals do not have to be colocalized or delivered simultaneously in order for the costimulation to be effective. (Pardigon et al, J. Immunol.)

Next year, we will study :
1) the origin and the differentiation as well as maturation steps of the so called thymus-independent T lymphocytes located in the gut epithelium, 2) the consequences of CD8 T lymphocytes costimulation on the differentiation into effector and memory cells that migrate either in the lymphoid organs or in the lung and gut.

Thème 4 – Selection of murine alpha,beta T cell repertoire.. Responsable : Jean Kanellopoulos.

The main interest of our group is to study the T cell repertoire development in wild type and deficient animals and to elucidate the role of thymic nurse cells in the maturation of thymocytes. We have developed a second generation immunoscope technique which provided information on the number and characteristics of distinct CDR3 sequences contained in a peak of a given CDR3 length. Using this method, we have determined the size of the ab T cell repertoire of mouse splenocytes and of human blood lymphocytes. Furthermore, we have studied the ab repertoire of T splenocytes in terminal deoxynucleotidyl transferase KO mice and in H-2K°/°, H-2D°/° double KO animals. Our current work focuses on the selection of mouse T cell repertoires by a single peptide-MHC class I complex. Using "Representational Difference Analysis", we are looking for genes only expressed in thymic nurse cells (TNC) in order to get insights in the function of such cells. In collaboration with Dr. David Ojcius at the Pasteur Institute,.we have started a project in which our knowledge in basic immunology can be applied to a public health problem : infection by the parasite Cryptosporidium Parvum.

Thème 5 :-Analysis of memory and effector T cell populations and search of the molecular basis of their phenotype.. Responsable : Philippe Kourilsky

This team has developed or mastered new tools required for the detailed analysis of T cell repertoires. Indeed, Immunoscope II now enables the analysis of their diversity down to the TcR gene sequences. Used sequentially together with techniques for T cell sorting based on MHC-peptide complex multimers, this tool has already allowed powerful analyses of T cell repertoires in a variety of situations. Once assembled into an integrated platform, these technologies will soon be used for the immunmomonitoring of clinical trials. Besides, this team has recently initiated a project aiming at the caracterization of epigenetic alterations occurring during the differenciation of T cells into effector or memory cells. The RLGS-M methodology is being used to localize these modulations of DNA meethylation. The ultimate goal is to gain insight into the molecular mechanisms responsible for immune memory.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Viviane CAPUT (TCE CNRS)
caput@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

        Jean-Pierre CABANIOLS  (ATER Collège de France)
        Jos EVEN  (CR1 CNRS)
        Laurent FERRADINI  (CR1 INSERM)
        Gabriel GACHELIN  (CL IP)
        Delphine GUY-GRAND  (DR0 INSERM)
        Jean KANELLOPOULOS  (DR2 INSERM)
        Iris MOTTA (CR1 INSERM)
        Christophe PANNETIER (CR DGA)
        Nathalie PARDIGON  (CR IP)
        David SOURDIVE (CR DGA)

Stagiaires de l'unité

Autre personnel de l'unité

        Armanda CASROUGE (IE INSERM)
        Sophie DALLE  (T Collège de France)
        Sylvie DARCHE  (IE INSERM)
        Christiane DELARBRE  (IR CNRS)
        Zacarias GARCIA  (T INSERM)
        Fabrice LEMAITRE (AI INSERM)
        Annick LIM (Ingénieur IP)

Publications de l'unité

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