Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Biologie moléculaire de l'Expression génique pour l'année 1999

CNRS URA 1773


Responsable : ISRAEL Alain (aisrael@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Les projets du laboratoire portent sur l'étude de deux systèmes de signalisation caractérisés par des événements inductibles de protéolyse, aboutissant au transport nucléaire de facteurs de transcription. Un premier projet concerne la famille de facteurs de transcription rel/NF-kappaB, dont l'activité est contrôlée par des mécanismes de rétention cytoplasmique impliquant des molécules appartenant à la famille IkappaB : divers types de signaux induisent la phosphorylation puis la dégradation de ces inhibiteurs, ce qui permet le transport nucléaire des complexes NF-kappaB. Nous étudions les diverses étapes de cette voie d'activation par des approches génétiques et biochimiques. D'autre part nous avons entrepris une approche à base de transgénèse et d'inactivation génique pour comprendre le rôle de l'activité NF-kappaB in vivo, au cours du développement et dans les différents tissus. Un second projet porte sur la protéine Notch, un récepteur transmembranaire impliqué dans la spécification des destins cellulaires qui se fait lors d'interactions cellules-cellules dans divers tissus. Des résultats récents de notre laboratoire suggèrent un mécanisme par lequel le signal Notch pourrait être transmis jusqu'au noyau : cette voie impliquerait une coupure protéolytique de Notch, suivie du transport nucléaire de la région intracellulaire qui se comporterait alors comme un activateur transcriptionnel, en utilisant une molécule d'ancrage à l'ADN que nous avons caractérisée dans le laboratoire. Nous avons reproduit une partie de cette voie d'activation dans un système de cultures de cellules, avons mis en évidence l'existence de trois événements de protéolyse qui semblent nécessaires à la transmission de ce signal et avons identifié deux des protéases responsables.

Abstract

The laboratory is interested in the analysis of two signaling pathways which are characterized by inducible cytoplasmic proteolytic events that result in nuclear translocation of transcription factors. One of the projects deals with the rel/NF-kappaB proteins, normally retained in the cytoplasm by a family of inhibitors (IkappaB's) which are inducibly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway following a large number of stimuli. Using biochemical and genetic approaches, we study the successive steps of this signaling cascade. Another approach to the same problem uses the techniques of transgenesis and gene inactivation to understand the function of NF-kappaB in vivo during developement and in the different tissues. A second project concerns the study of the Notch receptor, which is responsible for specifying cell fate following cell-cell interactions. Recent results from our lab have led to a model according to which the Notch receptor is processed by an intracytoplasmic protease following ligand binding, leading to the nuclear translocation of the intracellular part of this molecule, which in turn behaves as a transcriptional activator through association with a DNA-binding protein, Su(H), which we have characterized. We have reproduced this cascade in a cell culture system, have demonstrated that three proteolytic events seem to be necessary for signal transmission, and have identified the proteases involved in two of these events.

Texte du rapport

Analyse génétique des voies d'activation des facteurs de transcription NF-kappaB (G. Courtois, K. Schwamborn, R. Weil, S. Yamaoka, C. Bessia) La caractérisation de la protéine NEMO, sous-unité régulatrice du complexe de haut poids moléculaire IKK responsable de la phosphorylation inductible des inhibiteurs IkappaB, a été poursuivie. Des domaines différents impliqués dans l'activation de NF-kappaB par la protéine Tax de HTLV-I ou par les cytokines ont été définis. L'étude de l'implication de NEMO dans certaines pathologies humaines a été entreprise. Parallèlement une protéine présentant de fortes homologies avec NEMO a été identifiée : cette protéine semble impliquée dans une voie de signalisation différente de celle de NF-kappaB.

Analyse de l'activité NF-kappaB in vivo (S. Mémet, V. Fridmacher, A. Lilienbaum, E. Six, B. Goudeau) Cette question a été abordée par la construction de souris portant un gène lacZ sous le contrôle de sites de fixation pour NF-kappaB, permettant ainsi de visualiser les sites d'activation de NF-kappaB dans l'animal. Puis le gène codant l'inhibiteur IkappaB epsilon a été invalidé, permettant ainsi de préciser son rôle dans le système immunitaire. D'autre part une approche permettant d'exprimer de manière inductible l'inhibiteur IkappaB alpha dans un tissu donné a été entreprise. Un effort particulier a été porté sur le cerveau, organe que les souris portant le gène lacZ avaient montré comme étant un site important d'activité NF-kappaB. Dans cette optique la réponse aux signaux d'activation de NF-kappaB est étudiée dans des neurones en culture.

La voie de signalisation Notch (C. Brou, N. Gupta, F. Logeat, O. LeBail) Nous avons proposé un modèle selon lequel l'activation du récepteur Notch implique 3 étapes de protéolyse. L'enzyme responsable de la première étape a été identifiée : il s'agit de la furine, qui clive le récepteur dans sa région extracellulaire et donne naissance à deux parties qui restent associées par une liaison non-covalente. Cette coupure est nécessaire à l'expression à la membrane d'un récepteur fonctionnel. Une seconde étape de coupure nécessaire à l'activation, toujours dans la région extracellulaire, a été caractérisée. L'enzyme responsable a été identifié, du moins dans certains tissus, comme étant TACE, une métalloprotéase impliquée dans la maturation du TNF. Parallèlement les mécanismes impliqués dans l'instabilité de la forme nucléaire de Notch qui résulte de ces 3 étapes de clivage ont commencé à être caractérisés. D'autre part une approche de type transcriptome a été entreprise efin d'identifier les gènes-cibles de Notch.

Mots-clés : NF-kappaB, signaling, ubiquitin, brain, Notch, proteolysis, ADAM

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Marie-Dominique AYTAC

Chercheurs de l'unité

BROU Christel, IP
COURTOIS Gilles, INSERM
ISRAËL Alain, CNRS
LILIENBAUM Alain, CNRS
LOGEAT Frédérique, CNRS
MÉMET Sylvie, INSERM
WEIL Robert, CNRS

Stagiaires de l'unité

FRIDMACHER Valérie (post-doc)
GUPTA Neetu (post-doc)
SCHWAMBORN (post-doc)
SIX Emmanuelle (étudiante DEA)
YAMAOKA Shoji, Post-Doc (a quitté le laboratoire)

Autre personnel de l'unité

BESSIA Christine, technicienne IP
GOUDEAU Bertrand, AI CNRS (a quitté le laboratoire) HUCHET Stéphanie, IP
LE BAIL Odile, Ingénieur IP

Publications de l'unité

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