Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Biologie des Interactions Hôte-Parasite pour l'année 1999

CNRS URA 1960


Responsable : BRAUN BRETON Catherine (cbb@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Différents aspects des interactions hôte-parasite sont étudiés au sein de l’Unité : 1. Biologie des interactions hôte-Plasmodium, agent du paludisme Les études fondamentales que nous menons dans ce domaine tendent à une meilleure compréhension de mécanismes liés à des fonctions biologiques cruciales pour le développement du parasite chez l’hôte mammifère telles que : * l’invasion de la cellule hôte (équipe de C. Braun Breton) avec la caractérisation d'enzymes (protéases et phospholipases) impliquées dans la libération de mérozoïtes infectieux, la maturation de ces mérozoïtes ou la formation de la vacuole parasitophore au sein de laquelle se développe le parasite intraérythrocytaire * les voies de transport intracellulaire chez le parasite (équipe de D. Mattei) avec la caractérisation de protéines de la voie classique d’exportation (réticulum endoplasmique-Golgi) et la mise en évidence d’une voie alternative empruntée en particulier par des protéines transportées vers la surface de l’érythrocyte infecté * les stratégies d’échappements parasitaire (équipe d’A. Scherf) avec l'étude des modalités de la variation antigénique et du phénotype d’adhésion à l'endothélium vasculaire de P. falciparum, médiées par la même famille multigénique (var) et concourant à la physiopathologie de l'infection. * le maintien de l’intégrité et la création de la diversité du génome parasitaire (équipe d’A. Scherf) avec la caractérisation de la télomérase parasitaire et de son rôle dans l’immortalisation de P. falciparum 2. Immunopathologie de l’infection à Trypanosoma cruzi, agent de la maladie de Chagas Dans le cadre général des relations micro-organisme - système immunitaire, nous étudions (équipe de P. Minoprio) les mécanismes utilisés par T. cruzi pour échapper au système immunitaire de l’hôte mammifère. Le but est de comprendre comment les lymphocytes B et T activés par l’infection contribuent au développement d’une immunosuppression et d’une auto-immunité progressive. La caractérisation de molécules sécrétées par le parasite sécrète, in vivo et in vitro , et présentant une forte activité mitogénique pour les cellules B naïves peut ouvrir des perspectives importantes pour la mise au point de nouvelles cibles thérapeutiques. Les mécanismes de la pathologie chronique au cours de l'infection par T. cruzi sont l'objet de notre étude (équipe de M. Hontebeyrie). L'hypothèse de l'autoréactivité - autoimmunité a été privilégiée, basée sur une intense activation polyclonale des effecteurs immunitaires au cours de cette infection. Dans ce contexte, le mimétisme moléculaire entre les molécules de l'hôte et celles du parasite pourrait mener à une rupture de la tolérance vis-à-vis d'épitopes communs, créant ainsi un état d'autoréactivité délétère.

Abstract

Biology of Plasmodium-host interactions Our studies are aimed at an understanding of crucial biological steps involved in the development of Plasmodium falciparum within its human host. These include: C. Braun Breton et al. :
The invasion process of host erythrocytes with the characterization of enzymes participating in the release of merozoites, the maturation of merozoite surface proteins and the formation of the parasitophorous vacuole. D. Mattei et al. :
P. falciparum protein secretion pathways to the different cellular compartments implicating mechanisms and signals that are poorly understood. Plasmodium seems to possess two transport pathways: the endoplasmic reticulum-Golgi apparatus classical pathway, sensitive to the brefeldin A, probably including both the co-and post-translational translocation through the endoplasmic reticulum membrane and an brefeldin A insensitive, alternative pathway. A. Scherf et al. :
Analysis of two parasite escape mechanisms : antigenic variation and cytoadhesion of infected erythrocytes that are mediated by the multigene family var. The relation between specifique parasite adhesive phenotypes and physiopathology. Processes involved in chromosome maintenance and parasite immortalisation (telomerase) and genetic diversity. Immunopathology of Trypanosoma cruzi infection M. Hontebeyrie et al. are interested by the study of the mechanisms leading to chronic pathology during the infection by Trypanosoma cruzi responsible for Chagas'disease. The polyclonal activation of the immune effectors during this infection is the basis of the autoreactivity/autoimmunity hypothesis. In this context, molecular mimicry between host and parasite molecules should lead to the breakdown of tolerance towards common epitopes, inducing a state of deleterious autoreactivity. P. Minoprio et al. studies are focused on (1) understanding the host immune mechanisms involved in resistant phenotypes to this parasite, (2) characterizing processes allowing the parasite to escape the host immune response and (3) defining the immunosuppression responses of the host. Parasite molecules inducing B/T lymphocyte polyclonal activation and their contribution to the development of the immunosuppression and autoimmune tissue pathology associated with Chagas disease are currently studied.

Texte du rapport

I. Biologie des interactions hôte-Plasmodium Les études fondamentales que nous menons dans ce domaine tendent à une meilleure compréhension de mécanismes liés à des fonctions biologiques cruciales pour le développement du parasite chez l’hôte mammifère. Ces travaux peuvent à terme avoir des retombées dans l’identification de nouvelles cibles vaccinales et le développement de nouvelles molécules actives contre Plasmodium, dont le mode d’action serait radicalement différent de celui des molécules actuellement sur le marché vis à vis desquelles les parasites circulant en zone endémique présentent des résistances. 1. Invasion des globules rouges par les mérozoïtes de Plasmodium falciparum. (C. Braun Breton et al.) Nous avons étudié depuis plusieurs années, des enzymes impliquées dans le processus d’invasion des globules rouges par le parasite et dans la production de mérozoïtes (formes libres du parasite) capables d’interagir efficacement avec l’érythrocyte, préalable crucial au processus d’invasion une fois le cycle érythrocytaire enclenché. Nos premières études nous ont amenés à caractériser une protéase parasitaire (Pfgp76) indispensable au processus d’entrée du parasite dans sa cellule hôte et impliquée dans la formation de la vacuole parasitophore au sein de laquelle se développe le parasite intraérythrocytaire. Plus récemment, nous avons caractérisé une sérylprotéase de la famille des subtilisines (PfSUB2) qui semble impliquée dans la maturation de la protéine MSP1, protéine majeure de surface des mérozoïtes, indispensable à l’entrée du parasite dans l’érythrocyte. La caractérisation biochimique de cette enzyme est poursuivie, en particulier la définition de sa spécificité de substrat. Nous développons actuellement des inhibiteurs spécifiques de ces enzymes parasitaires qui pourraient mener à la définition de nouveaux antimalariques. Nous avons récemment cloné et séquencé le gène homologue à Pfsub2 chez un parasite murin, P. berghei, ouvrant ainsi la voie à des études génétiques et procurant un modèle expérimental pour valider cette enzyme comme cible thérapeutique. Nous avons montré que le processus de libération des mérozoïtes fait intervenir une phospholipase A hémolytique parasitaire susceptible de rompre la membrane de la vacuole parasitophore et la membrane plasmique de la cellule hôte ainsi qu’une protéase de type urokinase. Lors de son développement intra-érythrocytaire, le parasite exporte différentes structures membranaires au sein du cytoplasme de sa cellule hôte, et en particulier des structures applaties et localisées sous la membrane érythrocytaire appelées " Maurer’s clefts " et impliquées dans le transport de molécules parasitaires vers la surface de l’érythrocyte. Nous avons caractérisé une protéine de la membrane de ces structures de Maurer, PfSBP1. Notre étude nous conduit à proposer que les structures de Maurer assurent la sécrétion à la membrane érythrocytaire d’activités enzymatiques indispensables à la libération des mérozoïtes. Par une approche protéomique et génétique, nous cherchons à mieux caractériser plusieurs compartiments sécrétoires régulés du parasite impliqués dans la libération des mérozoïtes (structures de Maurer) et dans l’invasion des érythrocytes (rhoptries et granules denses). 2. Les voies de transport intracellulaire chez Plasmodium falciparum. (D. Mattei et al.) Nos études sur la sécrétion de protéines chez P. falciparum ont mis en évidence la complexité des voies de transport. Il semble que le parasite possède deux voies de transport des protéines : la voie classique du réticulum endoplasmique-appareil de Golgi, sensible à la bréfeldine A et dont nous avons isolé et caractérisé un constituant PfSec61a, qui pourrait présenter les systèmes de translocation co- et post-traductionelle à travers la membrane du réticulum endoplasmique, et une voie alternative insensible à la bréfeldine A. Il est à noter que chez P. falciparum, les signaux d’adressage des polypeptides vers le réticulum endoplasmique pourraient être différents de ceux utilisés par d’autres cellules eucaryotes : PfEMP1, qui ne possède pas de séquence signal, semble transiter par le réticulum endoplasmique de même que l’antigène 41-2 qui lui possède une séquence signal atypique. Ainsi, le parasite soit exprimerait des complexes de translocation différents reconnaissant des signaux d’adressage propres, soit serait capable de modifier les séquences signal pour les rendre reconnaissables par sa machinerie de translocation. En conclusion, nos résultats suggèrent que la machinerie de translocation de Plasmodium est similaire, mais non identique, à celle des cellules de Mammifères. L’étude des mécanismes, signaux et voies de transport spécifiques au parasite pourrait donc conduire à l’identification de voies de secrétion spécifiques au parasite représentant des cibles potentielles pour le développement de nouvelles drogues contre le paludisme. 3. Variation antigénique et adhésion des globules rouges infectés chez P. falciparum. (A. Scherf et al.) L'accès pernicieux marqué par des signes neurologiques et le paludisme pendant la grossesse restent des complications redoutables de l'infection par P. falciparum. Cette pathologie semble liée à la présence de protéines d'origine parasitaire, en particulier les protéines Var, à la surface des globules rouges, protéines médiant des phénomènes tels que l'adhésion de ces érythrocytes aux cellules endothéliales (séquestration). L'expression de variants de ces protéines se traduit par une dérive phénotypique (variation antigénique) résultant en une variabilité de l'adhérence des érythrocytes infectés à l'endothélium vasculaire. Afin d’étudier les mécanismes moléculaires permettant la régulation d’expression et de commutation (switching) des gènes var , trois populations isogéniques de P. falciparum ont été sélectionnées in vitro, jusqu’à ce que chacune d’entre elles n’adhère que sur un seul de ces trois récepteurs : CD36, ICAM1 ou CSA. Contrairement à ce qui est observé chez d’autres micro-organismes faisant appel à la variation antigénique, la commutation d’expression des gènes var ne s’est pas accompagnée de réarrangement programmé de l’ADN, faisant parler de commutation in situ. De façon inattendue, une transcription simultanée de tous les gènes var a été observée au stade anneau. En revanche, leur expression était étroitement régulée, par l’intermédiaire d’un mécanisme d’extinction (silencing) de tous les gènes de la famille sauf un, chez les trophozoïtes mûrs. Le contrôle transcriptionnel au stade trophozoïte semble donc mutuellement exclusif: une population parasitaire de phénotype de cytoadhérence défini n’exprimerait qu’un seul des gènes var présents dans son génome. Un ou des mécanismes épigénétiques sont donc impliqués dans la régulation d’expression des gènes var. Cependant, durant la méiose, nous avons détecté des réarrangements majeurs d'ADN impliquant les gènes var. Dans les progénies de deux croisements génétiques de P. falciparum, nous détectons des recombinaisons de gènes var entre chromosomes hétérologues. La méiose semble donc jouer un rôle crucial dans la génération de la diversité des gènes var ce qui pourrait expliquer que le répertoire des gènes var de souches différentes présente très peu de chevauchement. Notre travail confirme la liaison entre variation antigènique et variation du phénotype de cytoadhérence chez P. falciparum. La variation antigénique pourrait parfois s’accompagner d’une variation de tropisme parasitaire car la répartition des différents récepteurs endothéliaux n’est pas homogène d’un organe à l’autre. Cette variation de tropisme pourrait être liée à la variété clinique des formes graves du paludisme. En zone holoendémique, les femmes sont particulièrement susceptibles à l'infection par Plasmodium falciparum pendant leur première grossesse, avec des conséquences graves pour l'enfant (hypotrophie, mortalité infantile). L'adhérence élective d'une sous-population parasitaire à la chondroitine sulfate (CSA) - récepteur présent en grande quantité au niveau placentaire - est responsable de cette susceptibilité. Des parasites qui cytoadhèrent spécifiquement au récepteur CSA ont été sélectionnés et isolés par adhérence à des cellules endothéliales exprimant exclusivement ce récepteur. Nous avons ainsi pu caractériser un gène var spécifiant un ligand de CSA. La région de la protéine qui se lie avec la CSA a été identifiée. Ces résultats pourraient déboucher sur de nouvelles méthodes de contrôle du paludisme gestationnel : déséquestration placentaire ou immunoprophylaxie. 4. Mise en évidence d'une activité télomérase chez P. falciparum. (A. Scherf et al.) L'étude des télomères et de la télomérase de P. falciparum présente un intérêt scientifique fondamental mais aussi médical. Nous avons développé un test in vitro , le "Pf-TRAP", qui a permis de détecter, pour la première fois, une activité télomérase chez P. falciparum synthétisant de novo des répétitions télomériques à l'extrémité 3' du substrat fourni. Nos résultats suggèrent que la télomérase est également impliquée dans la cicatrisation des cassures chromosomiques observées pendant les divisons mitotiques. La télomérase étant une transcriptase inverse spécialisée, nous avons testé l'effet de deux inhibiteurs de transcriptases inverses rétrovirales, l'AZT et l'Acyclo-GTP, et montré que ces substances inhibent efficacement l'activité télomérase parasitairein vitro. L'efficacité des molécules sur les parasites de culture et pour des singes infectés par P. falciparum sera évaluée. II. Immunopathologie de l’infection à Trypanosoma cruzi Cette recherche est fondamentalement centrée sur l'immunobiologie de la relation hôte-parasite afin de mieux connaître les mécanismes du système immun associés à la résistance ou permettant l'échappement du parasite. Notre modèle de travail, l'infection expérimentale de la souris par le protozoaire Trypanosoma cruzi, permet de plus d'approcher l'étude de l'immunosuppression et de l'autoimmunité pathologique, des altérations fréquemment associées à toute infection parasitaire. 1. Activation polyclonale et mimétisme moléculaire dans l’infection chronique (M. Hontebeyrie et al.) Le symptôme clinique le plus grave de la Maladie de Chagas (infection par le parasite protozoaire Trypanosoma cruzi) est la cardiomyopathie qui se développe plusieurs années après le début de l'infection. Les mécanismes qui conduisent à cette cardiomyopathie sont encore mal connus. La présence de lymphocytes T dans les infiltrats inflammatoires suggère une pathologie auto immune. L'association d'une activation polyclonale intense et la détection de nombreux anticorps autoréactifs appuient cette hypothèse. Nous nous intéressons aux cibles des lymphocytes T autoréactifs à l'origine des infiltrats tissulaires et plus particulièrement à la protéine ribosomale P2 de T. cruzi. Cette protéine appartient à la famille des protéines ribosomales acides caractérisées par une séquence C-terminale riche en glutamine et très conservée dans toutes les espèces. La protéine ribosomale P2 de T. cruzi (TcP2beta) a été exprimée dans différents vecteurs d'expression sous forme de MBP-TcP2, GST-TcP2 et His-Tag-TcP2. La protéine ribosomale P2 de T. cruzi : un exemple de mimétisme moléculaire. Nous avons étudié la réponse humorale contre la TcP2 chez la souris infectée chronique et chez la souris immunisée par la protéine recombinante et nous avons préparé des anticorps monoclonaux. L'unique épitope B reconnu par les sérums de souris infectées est le peptide C-terminal, couvrant la séquence conservée. Dans le cas des souris immunisées par les TcP2 recombinantes, seules les souris immunisées par His-Tag-TcP2 reconnaissent la partie C-terminale, toutes reconnaissent deux épitopes majeurs internes à la protéine (manuscrit soumis). Trois anticorps monoclonaux ont été obtenus contre la TcP2. L'anticorps monoclonal 17.2 est spécifique de la partie C-terminale et les monoclonaux 68.3 et 40.4 reconnaissent un épitope interne à la molécule. L'anticorps monoclonal 17.2 marque en microscopie électronique les ribosomes du parasite mais également les ribosomes des cellules de mammifères (cellules Hela). En collaboration avec Mariano Levin (Argentine) et Gerd Wallukat (Allemagne), nous avons montré que l'anticorps monoclonal 17.2 exerce un effet chronotropique sur les cardiocytes en culture et que cette activité est médiée par la reconnaissance d'un épitope sur la seconde boucle du récepteur beta1-adrenergique. Cette reconnaissance est inhibée spécifiquement par le bisoprolol. Des expériences in vivo sont en cours pour mesurer l'effet de ce monoclonal sur le rythme cardiaque et sur les électrocardiogrammes. L'étude de la réponse des lymphocytes T (CD4 et CD8) chez la souris immunisée est en cours. La protéine CRP (Complement regulatory protein) de T. cruzi : essai de vaccination. En collaboration avec Karen Norris (Etats-Unis), nous avons étudié la réponse des souris à l'immunisation par His-Tag CRP et par l'ADN nu correspondant à la séquence de la CRP. Seules les souris immunisées avec l'ADN sont capables d'induire des anticorps lytiques et sont donc protégées contre une infection d'épreuve par le parasite (manuscrit soumis). 2. Immunopathologie du processus infectieux à Trypanosoma cruzi (P. Minoprio et al.) Ce projet s’inscrit dans le cadre général de l’étude des mécanismes utilisés par Trypanosoma cruzi pour échapper au système immunitaire de l’hôte mammifère. Le but est de comprendre comment les lymphocytes B et T activés par l’infection contribuent au développement d’une immunosuppression et d’une auto-immunité progressive. Il a été montré que le parasite sécrète, in vivo et in vitro , des molécules présentant une forte activité mitogénique pour les cellules B naïves.Une de ces molécules, de 24 kDa, est une protéine qui fixe le Ca2+, et qui, lors de son injection chez la souris, induit une prolifération importante des lymphocytes B, accompagnée d’une immunosuppression humorale et cellulaire.Par des approches biochimiques et moléculaires, une autre protéine, de 45 kDa, présentant une activité mitogénique pour les cellules B, a été isolée et son gène cloné. La protéine recombinante de 45kDa présente en plus de l’activité mitogénique in vivo et in vitro, une fonction enzymatique nouvelle chez les organismes eucaryotes. Il semblerait que l’activité mitogénique de cette protéine soit dépendante de l’activité enzymatique. Ceci ouvrirait des perspectives importantes pour la mise au point des nouvelles cibles thérapeutiques. Une fraction protéique, isolée du cytosol des parasites, induit également l’activation, la prolifération et la différentiation des cellules B. L’activation des lymphocytes B par ces mitogènes est indépendante des cellules T et est à l'origine d'anticorps polyréactifs dont la majorité n'est pas spécifique des antigènes parasitaires mais réactive contre des antigènes du ‘soi’. L’absence d’activation polyclonale chez des souris résistantes à T. cruzi (ne présentant pas en particulier de pathologie chronique cardiaque) pourrait alors être corrélée à la présence dans leur sérum d’anticorps dirigés contre ces mitogènes. Une analyse multiparamétrique du répertoire des cellules B des souris résistantes ou sensibles, avant et après l’infection, a montré que le répertoire B préexistant chez les souris résistantes est effectivement composé d’anticorps multiréactifs et anti-’soi’, qui à la fois maintiennent l’auto-réactivité ‘physiologique’ et empêchent le développement d’une pathologie sévère, tout en facilitant le contrôle de l’infection aiguë. Des études en cours visent à déterminer le seuil d’activité polyclonale obtenu par l’utilisation de parasites dont l’expression de gènes spécifiant un ou plusieurs mitogènes, a été modulée. Si notre hypothèse est correcte, l’infection par ces parasites présentant un potentiel mitogénique réduit devrait être associée à une réponse polyclonale (non-spécifique) des cellules B plus faible et une réponse immune spécifique des antigènes parasitaires plus forte donc une situation plus favorable à la survie des animaux. L’activation polyclonale des cellules B et T est une caractéristique générale des processus infectieux à parasites, bactéries, champignons et virus. Ainsi, la caractérisation de molécules possédant un caractère mitogénique et/ou super antigénique peut être fondamentale lors des études à visée thérapeutique ou vaccinale.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

LOZNER Josyane

Chercheurs de l'unité

BARALE Jean Christophe
BRAUN BRETON Catherine
HONTEBEYRIE JOSKOWICZ Mireille
MATTEI Denise
MINOPRIO Paola
SCHERF Artur

Stagiaires de l'unité

BERRY Laurence
BUFFET Pierre
CHAMOND Nathalie
DEGRAVE Wim
FIGUEIREDO Luisa
GONDIM DE FREITAS Junior
LEKANA DOUKI Jean Bernard
PIRITT Lindsay
REINA SAN MARTIN Bernardo
SEPULVEDA Pilar
UZUREAU Pierrick

Autre personnel de l'unité

BERNEMAN Armand
BLISNICK Thierry
COSSON Alain
GRÉGOIRE Josyane
TANGUY Myriam
SCHEIDIG BENATAR Christine

Publications de l'unité

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