Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Biochimie cellulaire pour l'année 1999

CNRS URA 1129


Responsable : GOLDBERG Michel (goldberg@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Les travaux de l'Unité portent sur divers problèmes liés à la structure et à l'intégration des protéines dans plusieurs fonctions cellulaires: l'acquisition de la structure fonctionnelle des protéines in vitro et in vivo, les aspects énergétiques de leurs interactions, l'origine atomique de leur stabilité et de leur spécificité fonctionnelle, l'utilisation comme agents vaccinants de protéines modifiées par "greffage" de peptides artificiels et l'utilisation de protéines modifiées dans divers types d'applications biotechnologiques.

Abstract

Research in this Unit deals with a variety of problems related to the structure of proteins and their integration in several cellular functions such as the acquisition of the functional structure of proteins in vitro and in vivo, the energetic aspects of their interactions, the atomic origin of their stability and function, the use of modified proteins carrying "grafted" artificial peptides for vaccination, and the use of modified proteins in a variety of biotechnological applications.

Texte du rapport

L'Unité, dans la continuité de sa vocation de pépinière de groupes en émergence, a vu au cours de l'année 1999 deux de ses groupes prendre leur indépendance, l'un en devenant un laboratoire autonome implanté dans les locaux du Département d'Immunologie de l'Institut Pasteur (voir le rapport d'activité du Laboratoire de Cytométrie Analytique et Préparative), l'autre en donnant naissance à une entreprise privée de biotechnologies. Les activités de ces groupes ne figureront donc plus dans le rapport de l'Unité de Biochimie Cellulaire. Par contre, un nouveau groupe s'est constitué au sein de l'Unité à partir d'un noyau provenant d'une autre unité de l'Institut Pasteur, et le compte rendu de ses activités est inclus dans le présent rapport. Compte tenu de ces remaniements, les recherches de l'Unité sont concentrées sur deux thèmes principaux: les mécanismes de repliement de protéines isolées en tube à essai ou dans la cellule, et l'ingénierie des protéines appliquée à diverses problématiques théoriques ou biotechnologiques.

I- Repliement des protéines in vitro
(Michel Goldberg)

Ces recherches portent sur la connaissance, au niveau fondamental, des mécanismes qui permettent à une protéine d'acquérir en quelques secondes la structure tridimensionnelle complexe, dite "native", qui lui confère ses propriétés biologiques. Les connaissances ainsi acquises sont utilisées pour améliorer la structuration des protéines, en particulier dans des processus industriels liés aux biotechnologies.

a- Etude des intermédiaires précoces de repliement (Michel Goldberg - V. Guez - Alain Chaffotte)

Nous avons poursuivi l'étude du couplage entre la formation d'interactions à longue portée (les ponts disulfures) et l'apparition de structures locales (les alpha-hélices et les brins beta de la structure secondaire) lors des étapes précoces du repliement d'une protéine modèle particulièrement bien adaptée, le lysozyme de poule. Partant de l'obervation que la structure secondaire du lysozyme se forme très rapidement lorsque les 4 ponts disulfures sont préformés, alors qu'elle n'apparait pas en leur absence, nous avons cherché à identifier ceux des ponts disulfures qui sont essentiels à la formation très rapide de la structure secondaire. Pour cela, nous avions construit au cours des années précédentes 4 doubles mutants dans chacun desquels les 2 cystéines engagées dans l'un des 4 ponts S-S avaient été remplacées par 2 alanines. Les protéines correspondantes sont exprimées dans E. coli sous forme de protéines agrégées insolubles (corps d'inclusion). Nous avons cette année réalisé la solubilisation, la purification et la renaturation oxydative de 3 de ces protéines mutantes, ce qui nous a permis d'obtenir plusieurs dizaines de milligrammes de chacune d'elles sous la forme native fonctionnelle avec leurs ponts disulfures correctement formés. La méthode de préparation pourra être, si besoin est, facilement transposée au 4ème mutant.

L'une des protéines mutantes a été caractérisée par une série de critères spectroscopiques, hydrodynamiques et fonctionnels qui ont permis de confirmer la très grande similarité structurale des protéines "naturelle" (avec 4 ponts disulfures) et "mutante" (avec 3 ponts disulfures). Après avoir déstructuré la protéine à l'aide de guanidine (un agent qui détruit les structures natives sans apporter de modification chimique à la molécule) nous avons observé les différentes phases de son repliement en utilisant un mélangeur rapide qui permet d'éliminer l'agent déstructurant en moins de 4 millièmes de secondes. Nous avons ainsi pu démontrer que la suppression du pont disulfure entre les aminoacides n° 30 et 115 n'empêche pas, dans le mutant correspondant, la formation de la structure secondaire, qui se produit en un temps très court (moins de 4 millisecondes) aussi bien chez ce mutant que dans la protéine naturelle. Par contre, la supression de ce pont disulfure permet une accélération des étapes les plus lentes du repliement, étapes qui impliquent des réajustements locaux de la conformation de la protéine. Ces observations constituent l'une des premières démonstrations expérimentales du modèle du "paysage énergétique" récemment proposé par les théoriciens pour expliquer le repliement rapide des protéines.

Poursuivant nos recherches sur les événements les plus précoces du repliement d'une petite protéine repliée autour d'un feuillet beta central, la thiorédoxine de la bactérie E. coli, nous voulons déterminer l'importance de la formation de ce feuillet beta dans le processus de repliement. Pour cela, nous cherchons à identifier, puis à caractériser des fragments complémentaires de la protéine susceptibles de se réassocier sous forme structurée. Nous avons donc entrepris une étude visant à mettre en évidence la complémentation structurale de paires de fragments in vivo a l'aide d'un test fondé sur la complémentation fonctionnelle de fragments de l'adényl cyclase de B. pertussis par la technique de double hybride bactérien (cf. section IV plus loin). La construction a consisté à fusionner le domaine T25 de la cyclase à l'extrémité N-terminale du fragment 1-73 de la thiorédoxine cependant que le fragment 74-108 est lui-même fusionné à son extrémité C-terminale au domaine T18 de la cyclase. La complémentation entre les fragments de la thiorédoxine est actuellement en cours d'étude. Elle sera testée dans une bactérie déficiente en cyclase par la restitution du phénotype Mal+ due au rapprochement physique et fonctionnel des fragments T25 et T18 de la cyclase. Ce test de complémentation pourra être ensuite utilisé à des fins prospectives pour identifier d'autres sites permissifs vis-à-vis de la complémentation "intra-domaine" de la thiorédoxine et permettre ainsi, grâce à des études structurales, d'approfondir le rôle déterminant du feuillet beta central dans l'acquisition de la structure de la thiorédoxine.

b- Utilisation de sulfobétaines non détergentes pour améliorer le repliement in vitro (Michel Goldberg - V. Guez)

La renaturation in vitro, fréquemment utilisée pour la préparation de protéines produites par manipulations génétiques, est souvent très peu efficace du fait de la formation de molécules mal repliées, insolubles, inactives. En collaboration avec une équipe du CEA de Grenoble, nous étudions depuis quelques années une famille de molécules, les sulfobétaines non détergentes, dont certaines s'avèrent être d'excellents "adjuvants" qui minimisent la formation de protéines mal repliées, et améliorent considérablement l'efficacité de la renaturation. C'est en utilisant cette famille de molécules que nous sommes parvenus à renaturer et oxyder efficacement les mutants du lysozyme décrits au paragraphe précédent.

c- Modélisation moléculaire de l'énergie d'association entre protéines (Arnaud Blondel)

Les activités de ce groupe sont axées sur l'étude expérimentale et théorique des associations entre macromolécules biologiques. Elles visent à améliorer les méthodes de modélisation de telles associations impliquées dans divers processus biologiques. L'amélioration et la fiabilisation de ces méthodes est un enjeu très important car elles sont de plus en plus utilisées dans la conception de nouveaux agents thérapeutiques. Nos travaux sont réalisés sur une protéine, la dihydrofolate réductase DHFR R67, formée par l'association de 4 sous-unités identiques. Des variants de cette protéine permettant de sonder l'importance des différents contacts de l'association ont été construits par génie génétique. Leurs associations sont caractérisées, sur le plan énergétique, par diverses méthodes physico-chimiques. En parallèle, l'énergie de ces associations est modélisée à l'aide d'un programme informatique, CHARMM, auquel nous avons apporté des modifications pour permettre la simulation de la protéine en tenant compte des molécules d'eau dans laquelle elle baigne. Les calculs sont effectués sur super-calculateurs (Cray T3E, SGI PowerChallenge, etc...) et sur stations de travail Unix.

Pour sonder quantitativement la contribution des liaisons hydrogène à l'énergie de l'association, nous poursuivons l'étude de l'effet du remplacement par divers acides aminés de l'histidine H62 et/ou de la sérine S59, impliquées dans la formation d'une liaison hydrogène à l'interface entre deux dimères de la DHFR R67. Nous avions, au cours de l'année précédente, montré que tous les mutants obtenus étainet dimériques et inactifs, mais que le mélange de certains couples de dimères mutants aboutit à la formation de molécules actives, hétérotétramériques. Nous avons cette année déterminé la constante d'équilibre d'association-dissociation de ces hétérotétramères à l'aide d'une méthode de mesure très précise que nous avions mise au point. Au cours de cette étude, nous avons observé que l'assemblage de certains dimères mutants en hétérotétramères n'obéissait pas à un modèle simple d'association-dissociation. Pour rendre compte des résultats expérimentaux, nous avons conçu et utilisé un modèle plus complexe faisant intervenir un échange de sous-unités entre les deux dimères. Ce modèle a d'abord été validé par un ensemble d'expériences biochimiques et cinétiques. Il a ensuite été utilisé pour déterminer de manière rigoureuse et précise les constantes d'association entre dimères au sein des hétérotétramères.

En parallèle, nous avons poursuivi le développement de méthodes informatiques permettant de modéliser l'effet de mutations sur la constante d'équilibre d'association. Pour cela, nous avons mis au point un programme, fondé sur l'introduction progressive simulée des mutations, et calculant à chaque étape les changements d'énergie d'association entre dimères "partiellement" mutés. Dans un premier temps, nous obligions, à chaque étape d'"augmentation" de la mutation, la conformation à se relaxer à partir de la conformation de la DHFR native. Devant les divergences significatives entre les énergies obtenues pour l'un des hétérotétramères (H622:S59A) soit par modélisation soit par la mesure expérimentale, nous avons modifié le programme de calcul. A chaque étape d'incrémentation informatique de la mutation, nous laissons maintenant la conformation de la moléclue se relaxer à partir de la conformation simulée atteinte à l'étape précédente. Les calculs (environ deux mois de calcul pour une paire de mutations!) ne sont pas achevés à ce jour et nous ne savons pas encore quelle sera la qualité de l'accord entre modélisation et expérience. Cependant, les résultats préliminaires déjà obtenus montrent une considérable amélioration de la modélisation.

Outre l'approche quantitative décrite ci-dessus, le groupe de modélisation a contribué aux recherches de deux autres unités de l'Institut Pasteur en tentant de prédire la structure de complexes entre une protéine et l'un de ses ligands spécifiques. Ainsi, un modèle structural a pu être proposé pour identifier la fonction d'une protéine inconnue d'une cyanobactérie (collaboration avec l'Unité de Physiologie Microbienne). Par ailleurs, des recherches sont en cours pour tenter d'identifier le site d'interaction entre une protéine impliquée dans la croissance cellulaire, la nucleoside-diphosphate kinase, et l'un de ses ligands, l'ADN (collaboration avec l'Unité de Régulation Enzymatique des Activités Cellulaires)

d- Cinétique d'association-dissociation de la DHFR R67 (Annick Méjean)

Notre étude de l'équilibre dimères-tétramères de la DHFR R67 se poursuit en parallèle avec celle des vitesses d'association et de dissociation, observées lors de sauts de pH provoqués dans un mélangeur rapide (stopped-flow). Dans la continuité de nos travaux de l'an dernier, nous avons analysé en détail l'effet du pH sur l'allure des cinétiques d'association ou de dissociation. Cette étude a abouti à un "modèle carré" selon lequel le chemin cinétiquement privilégié ne serait pas le même selon que la molécule aille de la forme tétramérique à la forme dimérique ou vice versa. En effet, nous avons pu confirmer que l'évènement qui déclenche la dissociation du tétramère est sa protonation. Au contraire, c'est la dé-protonation du dimère qui provoquerait son association. Cette observation est importante pour la modélisation de l'effet du pH sur les constantes d'équilibre à pH neutre.

II- Contrôle du repliement des protéines de l'enveloppe bactérienne (Jean-Michel Betton)

La réponse cellulaire aux stress, extrêmement conservée parmi toutes les espèces vivantes, se traduit par la synthèse accélérée d'un ensemble de protéines, les protéines de choc thermique ou Hsp, dont le rôle est de maintenir la survie de la cellule dans des conditions qui provoquent la dénaturation et l'agrégation des protéines. Chez la bactérie Escherichia coli, la réponse aux stress extra-cytoplasmiques est régulée par deux systèmes distincts, la voie Cpx (système à deux composants où CpxA joue le rôle de senseur et CpxR d'activateur de l'expression de certains gènes) et la voie de régulation du facteur de transcription sigmaE (où RseA agit comme un antagoniste de sigmaE). La compartimentation cellulaire des bactéries Gram-négatives implique des mécanismes spécialisés dans le contrôle de qualité du repliement des protéines de l'enveloppe permettant (i) de détecter la présence de protéines incorrectement repliées dans ce compartiment et (ii) de transmettre cette information à travers la membrane interne. La nature exacte des stimuli capables d'induire spécifiquement ces deux voies de signalisation est loin d'être établie, mais quels qu'ils soient, ces deux systèmes activent l'expression, entre autres, des gènes de choc thermique fkpA ou degP/htrA qui codent respectivement pour une peptidyl-prolyl isomérase ou PPIase (enzyme qui catalyse l'isomérisation cis/trans des liaisons peptidiques impliquant un résidu proline) et pour une protéase à sérine dégradant les protéines d'enveloppe incorrectement repliées. Par ailleurs ces deux protéines sont impliquées dans la virulence de nombreuses bactéries pathogènes.

Afin de comprendre les mécanismes de reconnaissance et de régulation cellulaires liés à la présence de protéines d'enveloppe anormales, nous utilisons l'expression d'un mutant d'une protéine périplasmique modèle, la protéine affine du maltose ou MalE31, dont le repliement défectueux conduit à l'accumulation d'espèces protéiques incorrectement repliées qui s'agrègent et forment des corps d'inclusion dans le périplasme. Nous examinons les effets de l'inactivation de deux gènes degP/htrA et fkpA sur l'induction les deux voies de signalisation en utilisant l'activité promotrice du gène degP (à l'aide d'une fusion transcriptionnelle degP/htrA-lacZ) et l'analyse biochimique des protéines d'enveloppe qui sont distribuées entre les fractions soluble/exportée (extrait périplasmique) et insoluble (extrait membranaire), préparées à partir de sphéroplastes. Cette technique, que nous avons mise au point, permet de quantifier la partition cinétique entre les voies productives (vers la structure native) et les voies non productives (vers l'agrégation) qui existe au cours du repliement cellulaire des protéines. L'effet de la température sur la croissance des bactéries surexprimant malE31 est activement étudié car nous avons observé que si aucun phénomène d'interférence ou d'inhibition de l'exportation, lié à la surproduction de ce variant, n'était détecté à 30°C, un phénotype thermo-sensible (et léthal) pouvait s'observer à 37°C, mais pas à 42°C. D'autre part, nous étudions les relations structure-fonctions des deux protéines de choc thermique FkpA et DegP/HtrA qui contrôlent le repliement et l'assemblage des protéines de l'enveloppe. Pour FkpA, nous venons de mettre en évidence que son activité chaperon, indépendante de son activité PPIase, est capable de prévenir l'agrégation périplasmique de MalE31. Pour DegP/HtrA, nous étudions son organisation structurale afin de comprendre les mécanismes qui lui permettent la reconnaissance spécifique des protéines incorrectement repliées. Pour cela, nous cherchons à déterminer le rôle respectif des deux domaines PDZ, qui forment la partie C-terminale de la protéase, dans les processus d'assemblage fonctionnel et de fixation des substrats.

Enfin, nous avons participé à l'évaluation d'un système de production de protéines in vitro, basé sur le couplage transcription-traduction à haut rendement, qui sera commercialisé par la société Roche Diagnostic sous le nom de Rapid Translation System (RTS) à l'automne prochain.

III- Ingénierie des protéines (URL www.pasteur.fr//units/bcel/peng) (Hugues Bedouelle

Nos recherches sont focalisées sur les relations entre la structure tridimensionnelle des macromolécules, leurs fonctions, et leur stabilité conformationnelle. Elles concernent des protéines du système immunitaire ou d'agents infectieux. Notre but consiste à comprendre les mécanismes d'action et d'évolution de ces protéines au niveau atomique, à améliorer leurs propriétés pour les utiliser dans la lutte contre les agents infectieux, et à concevoir des molécules inhibitrices. Nous utilisons les différentes approches de la biologie structurale prise au sens large, et en particulier les méthodes de mutagenèse et d'évolution dirigée in vitro.

a- Maturation de l'affinité des anticorps (Patrick England, H. Bedouelle)

Des mutations hypersomatiques améliorent l'affinité des anticorps durant la phase secondaire de la réponse immunitaire contre un antigène. La compréhension de leur mode d'action serait utile pour manipuler les anticorps en vue d'applications. Nous avons choisi l'anticorps mAbD1.3, dirigé contre le lysozyme de poule, comme modèle expérimental. mAbD1.3 contient 5 mutations somatiques non-silencieuses qui se sont produites durant le processus de maturation in vivo. Après avoir reconstitué l'anticorps germinal dont mAbD1.3 provient, nous avons évalué l'importance énergétique et cinétique de chacune des mutations somatiques, prise individuellement ou en combinaison, en utilisant l'appareil BIAcore. Les mutations induisaient une amélioration globale d'affinité d'un facteur 60, due à une diminution de la vitesse de dissociation. Leurs effets étaient additifs et indépendants du contexte. Par conséquent, leur ordre d'apparition n'était pas important. La plus grande partie de l'amélioration d'affinité était due à une seule mutation somatique, VL-N50Y, qui affecte un résidu de l'interface entre mAbD1.3 et le lysozyme. Plusieurs projets du groupe visent maintenant à augmenter l'affinité d'anticorps pour leurs antigènes par des méthodes de maturation d'affinité in vitro.

b- Construction de biocapteurs à partir d'anticorps (Martial Renard, H. Bedouelle)

Une macromolécule peut être transformée en biocapteur si la reconnaissance spécifique d'un ligand change une propriété physique mesurable. La fixation du ligand et la transduction du signal sont alors intégrées dans un même évènement et permettent une détection quantitative immédiate du ligand. Nous développons un ensemble d'approches pour transformer les anticorps en biocapteurs moléculaires. Nous avons choisi l'anticorps monoclonal mAbD1.3 comme système expérimental car des données structurales détaillées sont disponibles. Ces approches seront étendues à des anticorps pour lesquels les données structurales n'existent pas, puis à d'autres types de récepteurs. Ces biocapteurs pourraient avoir de nombreuses applications en diagnostic, en pharmacologie et dans l'industrie.

c- Bases structurales des réactions immunitaires croisées: cas des sérotypes viraux (Laurent Belkadi, H. Bedouelle)

La plupart des virus possèdent plusieurs sérotypes, qui peuvent être distingués au moyen d'anticorps spécifiques. Inversement, certains anticorps monoclonaux peuvent reconnaître plusieurs sérotypes. La compréhension de ces réactivités croisées est importante pour l'utilisation d'anticorps recombinants en immunothérapie passive. Nous analysons ce phénomène de réactivité croisée pour un anticorps monoclonal qui est dirigé contre le virus de la dengue et reconnaît ses 4 sérotypes avec des efficacités variables. Chaque résidu des boucles hypervariables CDR3 de l'anticorps a été changé en alanine. Les variations d'affinité pour des protéines d'enveloppe recombinantes, Env1 et Env2, des sérotypes 1 et 2 du virus, et les vitesses d'interaction correspondantes ont été mesurées par une méthode d'ELISA de compétition et par BIAcore. L'affinité de l'anticorps était plus petite pour Env2 que pour Env1. Les résultats de mutagenèse déjà obtenus, qui concernent la boucle hypervariable CDR3 de la chaîne légère, montrent qu'un même résidu de tryptophane est prépondérant à la fois pour la reconnaissance de Env1 et celle de Env2. Les autres résidus de la boucle CDR3 forment des contacts plus énergétiques avec Env1 qu'avec Env2.

d- Effet de contexte dans l'évolution des protéines (H. Bedouelle).

L'évolution naturelle procède par accumulation de mutations ponctuelles. Par quel mécanisme ce processus séquentiel permet-il l'évolution d'interaction tertiaires dans les protéines et celle de leur stabilité? Quelles sont ses implications pour l'amélioration de la stabilité des protéines par des méthodes d'évolution dirigé in vitro?. Nous avons étudié une interaction tertiaire, au croisement de deux hélices-alpha, dans la tyrosyl-ARNt synthétase (TyrRS) du thermophile Bacillus stearothermophilus. Les résidus impliqués, Ile52 et Leu105, sont changés en Leu et Val respectivement dans la TyrRS du mésophile E. coli. Nous avons construit les mutations correspondantes dans la TyrRS de B. stearothermophilus. Les deux mutations affectaient la stabilité du dimère de TyrRS à des étapes différentes de son dépliement. L'une déstabilisait l'association entre les sous-unités et l'autre déstabilisait l'intermédiaire monomérique de dépliement. Les deux chemins mutationnels, allant du type sauvage de la TyrRS au double mutant I52L-L105V, en passant par l'un ou l'autre des deux simples mutants, n'étaient pas équivalents. L'un des chemins comprenait deux étapes neutres pour la stabilité (I52L permettant L105V) tandis que l'autre chemin comprenait une étape déstabilisatrice (L105V) suivie et compensée par une étape stabilisatrice (I52L). Ainsi, les effets de I52L et L105V sur la stabilité dépendaient du contexte structural et nos résultats sont compatibles avec la théorie de l'effet de contexte dans l'évolution des protéines.

e- Structure modulaire de la tyrosyl-ARNt synthétase (Valérie Guez, H. Bedouelle).

Beaucoup de protéines naturelles ont été formées par l'assemblage de modules ou de domaines préexistants, et cette observation a inspiré de nombreuses approches en ingénierie des protéines. La tyrosyl-ARNt synthétase (TyrRS) est un homodimère alors que la plupart des 9 autres synthétases de classe I sont des monomères. Le site de fixation du tRNA-Tyr est partagé entre les deux sous-unités. Chaque sous-unité comprend deux domaines structuraux: un domaine N-terminal (résidus 1-319 chez B. stearothermophilus) qui possède le repliement caractéristique de la classe I, le site catalytique, et l'interface de dimérisation; et un domaine C-terminal (résidus 320-419) qui fixe l'anticodon du tRNA mais qui est désordonné dans la structure cristalline.

Nous avons étudié le dépliement du fragment N-terminal par l'urée et montré l'existence d'un équilibre thermodynamique entre l'état dimérique natif, un état intermédiaire monomérique replié, et l'état déplié. Ces résultats ont suggéré que la TyrRS s'est formée par l'association de deux monomères repliés mais inactifs. L'état de repliement du fragment C-terminal a été caractérisé en solution par des techniques biophysiques et comparé avec ceux de la TyrRS complète et de son fragment N-terminal. Ces caractérisations ont montré que le domaine C-terminal était dans un état condensé, stable, et défini de repliement, et qu'il avait des structures similaires dans sa forme isolée et dans la TyrRS complète. Elles ont montré que le désordre du domaine C-terminal dans les cristaux est due à la flexibilité du peptide qui le lie au domaine N-terminal et que les domaines N- et C-terminaux ne forment pas d'association stable. La TyrRS est ainsi une exception parmi les aminoacyl-ARNt synthétases, en ce qu'elle n'a pas formé d'interaction tertiaire forte entre son domaine de fixation de l'anticodon et le reste de la molécule, ni à l'intérieur de la même sous-unité comme les autres synthétase de classe I, ni entre sous-unités comme les synthétases de classe II.

Nous avons déterminé la structure tertiaire du fragment C-terminal par spectroscopie de RMN hétéronucléaire en solution, en collaboration avec le laboratoire de RMN de l'Institut Pasteur. Sa structure est similaire à celles de la protéine ribosomale S4 et de la protéine de choc thermique Hsp15. Ces 3 protéines ont donc recruté un même domaine pour fixer l'ARN.

IV- Toxines recombinantes d'intérêts thérapeutiques ou biotechnologiques (Daniel Ladant - Agnès Ullmann)
Cette équipe étudie, depuis plusieurs années, la toxine adénylcyclase (AC) produite par Bordetella pertussis, l'agent de la coqueluche. Cet enzyme sécrété par B. pertussis constitue l'une des toxines essentielles de cet organisme. L'AC possède la capacité de pénétrer dans les cellules eucaryotes cibles où, activé par la calmoduline (CaM), elle synthétise activement de l'AMP cyclique altèrant ainsi le métabolisme cellulaire. Cette thématique générale recouvre à l'heure actuelle deux aspects assez différents qui ont en commun le fait d'exploiter les propriétés originales de cette toxine bactérienne.

a- Analyse des mécanismes d'invasion cellulaire et applications à la vectorisation d'épitopes in vivo.

La toxine AC possède la propriété originale de pouvoir délivrer son domaine catalytique N-terminal dans le cytoplasme des cellules cibles directement à travers la membrane cytoplasmique de ces cellules. En collaboration avec l'équipe de C. Leclerc (Institut Pasteur), nous avons utilisé la toxine AC comme système vecteur pour délivrer des épitopes T CD8+ (inséré dans le domaine catalytique) dans les cellules présentatrices d'antigènes afin d'induire in vivo des réponses immunitaires à médiation cellulaire (lymphocytes T cytotoxiques). Au cours de l'année 1999 nous avons montré que des polypeptides comportant jusqu'à 190 acides aminés peuvent être insérés dans le domaine catalytique de la toxine AC sans que cela n'affecte sa translocation dans les cellules eucaryotes. L'étude de ces toxines chimériques a permis de mettre en évidence par ailleurs, le rôle de la flexibilité conformationnelle du domaine catalytique pour sa translocation à travers la membrane des cellules cibles. Ces résultats illustrent la remarquable tolérance de la toxine AC et ouvrent des perspectives prometteuses pour l'utilisation de telles protéines recombinantes pour l'activation de réponses CTL dirigées contre des antigènes viraux et/ou tumoraux.

b- Système double-hybride bactérien, fondé sur la complémentation fonctionnelle de deux fragments du domaine catalytique de l'AC

Nous avons exploité les caractéristiques structurales de domaine catalytique adénylcyclase, pour développer un "système double hybride bactérien" (DHB) qui permet de détecter in vivo, chez Escherichia coli, par des tests phénotypiques simples, des interactions protéine-protéine. Ce système est fondé sur la complémentation fonctionnelle de deux fragments complémentaires du domaine catalytique de l'AC fusionnés aux deux protéines d'intérêt. Dans une souche d'E.coli cya, l'association des deux protéines hybrides restaure l'activité enzymatique adénylcyclase, donnant lieu à une synthèse d'AMPc qui active les opérons cataboliques. Cette cascade d'activation est détectable par criblage sur des milieux indicateurs ou sélectifs. Ce système double-hybride pourrait avoir de vastes applications pour l'analyse des relations structure/fonction des macromolécules biologiques, pour l'analyse fonctionnelle des génomes, ainsi que pour le criblage de molécules d'intérêts pharmacologiques. Au cours de l'année passée, nous avons poursuivi le développement de ce système "double-hybride bactérien" (DHB) pour le rendre plus performant, plus sensible et plus versatile. Un certain nombres d'améliorations techniques ont été apportées qui facilitent à la fois le criblage génétique d'interaction entre protéines hybrides et l'analyse biochimique subséquente des interactions entre les-dites protéines hybrides. Parallèlement nous avons exploité cette technologie pour analyser des interactions entre différentes protéines modèles (en collaboration avec différentes équipes).

V- Apport des méthodes physicochimiques de l'Unité à diverses collaborations (Alain Chaffotte - Michel Goldberg - Roland Nageotte)

Comme c'est le cas depuis de nombreuses années, l'Unité met au service de la collectivité scientifique, en particulier pasteurienne, son équipement et ses compétences dans l'étude physicochimique des protéines en solution et de leurs interactions. Elle participe à la conception d'expériences d'ultracentrifugation analytique, de spectroscopie de fluorescence, de dichroïsme circulaire, et de cinétiques rapides, réalise les expériences correspondantes et les interprète au bénéfice des équipes qui les sollicitent.

Les chercheurs de l'Unité ne signent les publications issues de ces travaux que si le contribution conceptuelle et expérimentale des membres de l'Unité a été déterminante. Cela a été le cas pour des travaux publiés ou réalisés cette année sur un peptide inhibiteur de l'intégrase du virus HIV-1 (collaboration avec S. Fernandjian - Institut Gustave Roussy), sur l'interaction entre un hemophore bactérien (HASA), l'hemoglobine et le récepteur membranaire de l'hemophore (collaboration avec C. Wandersman - Unité des Membranes Bactériennes - Institut Pasteur), sur la structure d'un peptide dérivé d'une interleukine (l'IL-2) qui agit comme agoniste de la chaine beta du récepteur de l'IL2 (collaboration avec J. Thèze - Unité d'Immunogénétique Cellulaire - Institut Pasteur), sur l'étude par dichroïsme circulaire de l'insertion d'un peptide syntétique rigide dans une phase lamellaire non ionique (collaboration avec N. Tsapis, Ecole Normale Supérieure), sur la détermination de la structure secondaire par dichroïsme circulaire de peptides synthétiques dérivés de toxines antibactériennes et insecticides de fourmis (collaboration avec V. Redeker, Ecole Supérieure de Physique et Chimie Industrielles), sur la détermination de la structure secondaire par dichroïsme circulaire de peptides dérivés de la glycoprotéine du virus de la rage (collaboration avec Y. Gaudin, CNRS Gif/Yvette) et sur l'étude de la stabilité conformationnelle de la thymidine monophosphate phosphate kinase (collaboration avec H. Munier-Lehmann, Laboratoire de Chimie Structurale des Macromolécules ­ Institut Pasteur)

VI- Enseignement

L'Unité a la charge de l'organisation du Cours de Biochimie des Protéines (Directeur A. Chaffotte) associé au DEA de "Structure, Fonction et Ingénierie des Protéines (Paris 6/ Paris 7/ Paris11/ ENS/ Polytechnique/ CEA), et une partie importante de ce cours est réalisée par le personnel de l'Unité. En particulier, le groupe d'Ingénierie des Protéines a organisé 3 semaines complètes de travaux pratiques dans le cadre de ce cours en 1999.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

LENOIR Lucile

Chercheurs de l'unité

BEDOUELLE Hugues, CNRS - hbedouel@pasteur.fr BETTON Jean-Michel, CNRS - jmbetton@pasteur.fr BLONDEL Arnaud, IP - ablondel@pasteur.fr CHAFFOTTE Alain-François, IP - chaffott@pasteur.fr DJAVADI Lisa, CNRS
ENGLAND Patrick, IP - england@pasteur.fr GOLDBERG Michel, IP
GUEZ Valérie, IP - vguez@pasteur.fr
KAMINSKI Pierre-Alexandre, IP
LADANT Daniel, CNRS - ladant@pasteur.fr MARLIERE Philippe, IP
MEJEAN Annick, UP7 - amejean@pasteur.fr

Stagiaires de l'unité

ARIE Jean-Phiippe, Thèse
BENSAADA Mustapha, Thèse
BODENREIDER Christophe, Thèse
DAM Julie, Thèse
DAUTIN Nathalie, Thèse
DORING Volker, Post-doc
GAILLARD Carole, DEA
GANDBHIR Meera, Post-doc
GMIRA Sakina, Thèse
HERVE Mireille, CNRS
KARIMOVA Gouzel, Post-doc
PLANSON Anne-Gaëlle, DEA
RENARD Martial, Thèse
ROSSY Emmanuel, DEA
ULLMANN Agnès, IP

Autre personnel de l'unité

BELKADI Laurent, CNRS
BELLALOU Jacques, IP
DRIDI Abel, IP
KIEFER-BIASIZZO Hélène, IP
LENOIR Lucile, IPLENOIR LucileL
METEZEAU Philippe, IP
NAGEOTTE Roland, IP
SASSOON-CLAVIER Nathalie, IP

Publications de l'unité

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