Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Arbovirus et Virus des Fièvres hémorragiques pour l'année 1999


Responsable : DEUBEL Vincent (vdeubel@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L’unité des Arbovirus et virus des fièvres hémorragiques se consacre à l’étude de deux familles virales représentatives des virus transmissible à l’homme par des arthropodes, les Flaviviridae et les Bunyaviridae ainsi qu’à la surveillance du virus Ebola (famille des Filoviridae). Des recherches à caractère fondamental ont pour objet de comprendre les mécanismes de la réplication de ces virus à ARN et d’analyser les interactions fonctionnelles entre l’agent infectieux et leurs cellules hôtes. A l’interface de ces recherches, le Centre National de Référence développe des outils de diagnostic rapide pour la surveillance des maladies émergentes associées aux arbovirus et aux virus des fièvres hémorragiques.

Abstract

The Unit of Arboviruses and haemorrhagic fever viruses conducts researches on two families of arthropod borne viruses, Flaviviridae and Bunyaviridae, and on the surveillance of Ebola virus (Filoviridae). Fields of basic research are dedicated to the understanding of the replication strategy of these RNA viruses and to the analysis of fonctional interactions between viruses and their host cells. The Unit also includes a reference branch wich develops rapid diagnostic tools for the surveillance of emerging diseases related to arboviruses and haemorrhagic fever viruses.

Texte du rapport

Les arbovirus ont été initialement définis comme “maintenus dans la nature par un cycle de transmission biologique entre des hôtes vertébrés permissifs et des arthropodes hématophages”. Certains d’entre eux ne correspondent pas à cette définition, mais ont été classés dans le catalogue des arbovirus pour leur apparenté écologique et non taxonomique. Plus de 100 virus pathogènes pour l’homme à des degrés divers sont universellement répertoriés. Ces virus entrainent des manifestations pathologiques qui sont à l'origine de symptomatologie inhérente liée à chaque virus (syndromes fébriles algiques, syndromes méningo-encéphalitiques, syndromes hémorragiques) pouvant conduire à la mort de l’hôte. Les virus des fièvres hémorragiques appartiennent aux familles des Bunyaviridae, des Flaviviridae, des Arenaviridae et des Filoviridae. La majorité de ces virus circulent sous les tropiques, en raison de l’abondance des hôtes et des vecteurs: c’est notamment le cas des virus de la fièvre jaune, de la dengue, de l’encéphalite du Nil Occidental (West Nile) et de la fièvre de la vallée du Rift. Plusieurs d’entre ces virus sont cependant retrouvés dans les zones tempérées, en Europe centrale, de l’est et du sud. Au niveau national, trois virus majeurs sont sous haute surveillance : les flavivirus de l’encéphalite à tique d’Europe centrale et West-Nile, introduit épisodiquement par les oiseaux migrateurs, et un hantavirus dont le réservoir est un rongeur auprès duquel l’homme se contamine. Beaucoup d’inconnues demeurent aux niveaux fondamental et épidémiologique sur les flavivirus, les bunyavirus et les filovirus. Notre Unité a développé en particulier des recherches pour six viroses importantes qui peuvent conduire à des encéphalites et des syndromes hémorragiques et qui posent de graves problèmes de Santé Publique dans plusieurs continents, et tout particulièrement dans les Départements et Territoires d’Outre-Mer ainsi que dans les pays où notre Institut est représenté: dengue, fièvre jaune, encéphalite de West Nile, fièvre de la vallée du Rift, fièvre hémorragique à virus Ebola, fièvre hémorragique avec syndrome rénal (virus Puumala). Nos activités de recherche et de référence sur les arbovirus et les fièvres hémorragiques virales ont dépassé les frontières et sont menées en collaboration avec nos partenaires privilégiés du réseau international des Instituts Pasteur et Instituts associés. Ces collaborations sont d'une grande richesse et favorisent le développement de la recherche grâce à des transferts d’information, de matériel et de technologies.

Le virus de la dengue

(V. Deubel)

La dengue est une maladie virale transmissible à l'homme par les moustiques du genre Aedes dans les régions tropicales et intertropicales qui ceinturent le globe. L’agent infectieux responsable de la maladie est un flavivirus (famille Flaviviridae) dont on distingue quatre sérotypes (dengue-1, -2, -3, et -4). L’infection par le virus dengue provoque généralement une fièvre non différenciée le plus souvent asymptomatique (fièvre dengue classique, DF, ou grippe des tropiques) mais peut entrainer des manifestations hémorragiques graves (fièvre hémorragique de la dengue, DHF), notifiées par une perméabilité vasculaire accrue et un déréglement de l'hémostase. L'issue de la maladie peut être fatale en cas de choc hypovolémique (dengue avec syndrome de choc, DSS). Les facteurs de l’hôte ou intrinsèques au virus responsables de la gravité de la maladie ne sont pas connus. Nos thématiques de recherche ont comme ligne directrice l’étude des marqueurs moléculaires de la diversité biologique du virus de la dengue qui déterminent de manière critique sa virulence et l’étude des mécanismes qui régissent les interactions du virus avec ses cellules hôtes.

Mécanismes de virulence du virus de la dengue

(P. Desprès, M.P. Courageot, M.P. Frenkiel)

Le virus de la dengue induit la mort cellulaire par apoptose des neurones murins infectés. L’infection du souriceau par le virus de la dengue est un modèle expérimental pour caractériser d’une part des marqueurs viraux de la virulence et d’autre part les interactions hôte-virus in vivo. Des variants hautement neurovirulents d’une souche humaine du virus de la dengue ont été sélectionnés après neuroadaptation à la souris. Les effets des substitutions en acides aminés dans la protéine d’enveloppe E et l’hélicase NS3 ont été comparés entre les variants neurovirulents et la souche parentale, d’une part dans les cellules hôtes in vivo et in vitro et d’autre part sur leur niveau d’infection des moustiques hématophages vecteurs. Les résultats indiquent que trois substitutions dans la protéine d’enveloppe E et une dans la protéine hélicase NS3 dans un variant neurovirulent confèrent une plus grande capacité du virus à se répliquer dans le système nerveux central murin. In vitro, la substitution dans NS3 semble interférer sur le cycle réplication du virus DEN dans les neuroblastomes et les substitutions dans la protéine E pourraient conférer au virus de la dengue une plus grande cytotoxicité pour les cellules de neuroblastome murin. (Collaborations : C. Duarte Dos Santos, F. Rey)

Inhibition de la maturation de la particule virale

(M.P. Courageot, P. Desprès, M.P. Frenkiel)

L’étude de la morphogenèse du virus de la dengue a montré que l’hétérodimerisation des glycoprotéines de l’enveloppe virale dans la lumière du réticulum endoplasmique (ER) est une étape préliminaire dans la formation de la particule virale. Le repliement correct des glycoprotéines prM et E dépendant de la maturation de leurs N-oligosaccharides est altéré par des inhibiteurs des a-glucosidases dans le ER. Nous avons démontré l’efficacité de ces inhibiteurs dans la production de particules virales dans des cellules en culture et chez les souris infectées par le virus de la dengue.

Pathologie liée au virus de la dengue

(P. Marianneau,V. Deubel, P. Desprès, M.T. Drouet)

Les organes cibles du virus de la dengue ne sont pas clairement identifiés. Cependant une atteinte hépatique a souvent été trouvée associée aux formes de DHF/DSS. L'analyse des biopsies de foie de patients décédés au cours d'un épisode de DHF/DSS ont permis d'identifier les hépatocytes comme des cellules cibles de l’infection par le virus de la dengue. Par contre, il n'a pas été possible de déceler du virus dans les cellules de Kupffer. Ces résultats corroborent nos analyses réalisées in vitro sur des hépatocytes et des cellules de Kupffer d'origine humaine en culture: le virus de la dengue infecte les deux types cellulaires et induit leur mort par apoptose. Cependant seuls les hépatocytes produisent du virus infectieux alors que les cellules de Kupffer activées par l'infection virale produisent des substances anti-virales et sont éliminées par phagocytose. L'étude de l'infection du tissu hépatique par le virus de la dengue, in vitro et in vivo, fournit des informations permettant de comprendre la pathologie de la maladie. (Collaborations : M. Huerre, L. Rosen, C. Royer, A.M. Steffan)

Propriétés biologiques de la glycoprotéine non structurale NS1

(M. Flamand, F. Mégret, S. Alcon, F. Coulibaly)

Parfaitement conservée au sein du genre des flavivirus, la glycoprotéine non structurale NS1 est essentielle à la survie du virus. Son rôle au cours de l’infection virale demeure à ce jour inconnu. Nous avons étudié la maturation et le transport de la protéine NS1 du virus de la dengue en cellules de rein de singe (lignée Vero). Nous avons montré que la protéine intracellulaire dimérique réside en grande partie dans un compartiment précoce des voies de sécrétion, où sa présence pourrait être requise lors de la réplication virale. Nous étudions par ailleurs les propriétés biochimiques et structurales de la forme sécrétée, qui pourrait assurer une fonction distincte au cours de l’infection virale. La protéine est relarguée dans le milieu de culture sous la forme d’un hexamère. La sécrétion de NS1 est favorisée par la maturation complète de l’un des deux sucres. Ces observations, associées à l’absence de production d’antigène NS1 extracellulaire dans des lignées de cellules d’insectes, dont la voie de biosynthèse des sucres génère des résidus oligosaccharidiques riches en mannoses, suggère que la N-glycosylation hôte-spécifique pourrait représenter un facteur de restriction du phénomène de production de NS1 sécrétoire. L’implication de la forme circulante de NS1 dans la pathophysiologie de l’infection chez l’homme est en cours d’étude. (Collaborations : M. Arborio, S. Dartevelle, B. Goud, R. Hellio, J. Krinsje-Locker, J. Lepault, F. Nato, F. Rey, A. Talarmin)

Vaccinologie de la dengue

(V. Deubel, M.T. Drouet, M.P. Frenkiel)

Le meilleur moyen de se prémunir contre le virus de la dengue serait une immunoprophylaxie efficace. Un vaccin recombiné composé de protéines de l'enveloppe virale E purifiées a été mis au point dans l'Unité. La protéine E du virus de la dengue induit chez la souris et chez le singe une immunité protectrice liée à la présence d'anticorps neutralisants. Ces résultats sont très encourageants pour la préparation d'un vaccin efficace contre les quatre sérotypes. (Collaborations : L. Edelman, S. Petres)

Analyse phylogénétique du virus West Nile

(V. Deubel, H. Zeller, S. Murri, M.T. Drouet)

Le virus West Nile a une large distribution géographique et a été découvert pour la première fois aux Etats Unis en 1999. L’amplification par RT-PCR d’un fragment du gène de la protéine d’enveloppe et l’étude comparative des séquences de plus de 40 souches virales d’Afrique, d’Europe, du Moyen Orient et des USA, a confirmé notre classification génétique des virus en deux lignées distinctes. Une lignée de virus n’est retrouvée qu’en Afrique, alors que l’autre s’est propagée hors de ce continent, sans doute par les oiseaux migrateurs. La souche virale isolée aux Etats Unis en 1999 est génétiquement très proche de celle qui circule en Israël depuis trois ans. (Collaborations : M. Malkinson, C. Bannet, R. Lanciotti, D. Gubler, C. Mathiot, R. Sylla Ba)

Le virus de la fièvre de la vallée du Rift (Michèle Bouloy)

Membre de la famille des Bunyaviridae (genre Phlebovirus), le virus de la fièvre de la vallée du Rift (FVR) est responsable de fièvres hémorragiques chez l'homme, d'avortements et malformations du foetus chez les ruminants. De graves épidémies viennent d’avoir lieu au Kenya, Somalie, Tanzanie et Mauritanie. Ce virus enveloppé possède un génome composé de trois segments d'ARN (L, M, S) de polarité négative dont un, le segment S, est ambisens et code pour deux protéines, la nucléoprotéine N et une protéine non structurale NSs dont la fonction n’est pas connue. L’étude de cette protéine a été au centre de nos préoccupations, avec comme ligne directrice l’analyse de ses propriétés biologiques et de la pathogénie associée au virus.

Transcription du virus de la fièvre de la vallée du Rift (C. Préhaud)

Du fait de sa stratégie ambisens, le segment S génomique est transcrit en un ARNm codant pour N et la molécule S antigénomique en un ARNm codant pour NSs. Un ARN modèle de type génomique ou antigénomique a été utilisé pour étudier cette phase de la transcription. Ces ARN sont transcrits par le système reconstitué où les protéines requises, N et L (ARN polymérase ARN dépendante) sont exprimées sous forme recombinante à partir du virus de la vaccine. L'ARN utilisé comme matrice est un minigénome qui contient le gène CAT (Chloramphénicol Acetyle Transférase) en orientation antisens, flanqué des séquences 3' et 5' non codantes du segment S d’orientation génomique ou antigénomique. Des mutations dans la région 3' terminale de la matrice indiquent que le complexe de transcription reconnait les 13 premiers nucléotides, parmi lesquels les 8 premiers sont conservés chez tous les phlébovirus, les positions 9 à 12 sont variables et la position 13 doit être une purine. La protéine NSs ne semble pas jouer de rôle particulier dans ce système de transcription. Nous cherchons à établir un système équivalent pour étudier la réplication et rechercher un éventuel rôle de NSs.

La protéine NSs
(F. Yadani et A. Kohl)

Dans les cellules infectées par la quasi totalité des souches, la protéine NSs se localise en majorité dans le noyau où elle forme une structure filamentaire. Afin de mieux comprendre les mécanismes de formation de filaments, la protéine a été exprimée à l’aide du vecteur Semliki. L’analyse de différents mutants ponctuels ou de délétion montre que le domaine formé par les dix acides aminés C-terminaux est responsable de la formation du filament mais pas de la localisation nucléaire. Dans la forme native de la protéine, ce domaine contient deux sérines qui sont phosphorylées et présentent une séquence consensus de reconnaissance par la caséine kinase II. Ces deux sites phosphorylés ne jouent pas de rôle important dans le processus de formation du filament car, la protéine où ces deux serines ont été mutées en alanine contine à former le filament nucléaire. (Collaboration : R. Hellio)

Un mutant naturel: le clone 13
(A. Billecocq, P. Vialat)

Le clone 13 a été isolé d’une souche de virus provenant d’un cas humain en République d’Afrique centrale. Ce virus possède une délétion de 70% de la région codante pour la protéine NSs et il est avirulent pour les rongeurs qui représentent un excellent modèle animal. Dans les cellules infectées par le clone 13, la protéine NSs tronquée ne forme pas de filament et reste dans le cytoplasme où elle est dégradée. En outre, les cultures de cellules Vero infectées par Clone 13 peuvent être propagées pendant de nombreux passages et continuent à héberger le génome viral et à exprimer ses protéines. Des réassortants avec une souche virulente ont permis de montrer que le caractère avirulent du clone 13 et sa capacité à établir des infections persistantes sont associés au segment S.

Analyse phylogénétique
(M. Bouloy, A.A. Sall)

La séquence codant pour la protéine NSs représente une cible de choix pour caractériser les souches entre elles. L’analyse phylogénétique d’une série de souches isolées de différentes régions d’Afrique au cours des 50 dernières années montre que les isolats se regroupent en trois classes géographiques: l’Afrique de l’Ouest, l’Afrique du Centre et de l’Est, l’Egypte. La séquence d’une souche isolée par R. Swanepoel (Joanesburg, Afrique du Sud) au cours de la dernière épidémie du Kenya de 1997-98 montre qu’elle appartient au groupe de l’Est et est génétiquement très proche d’une souche malgache isolée en 1991.

Centre national de référence et Centre collaborateur OMS des arbovirus et des fièvres hémorragiques virales

(H. Zeller, B. Murgue, V. Deubel, D. Coudrier, S. Murri)

Le CNR partage ses activités entre la mise au point de techniques diagnostiques et leur application au diagnostic individuel demandé par les praticiens et à l'étude de l'épidémiologie de certains de ces virus en France et à l'étranger. Il produit et distribue les réactifs nécessaires au diagnostic des principales arboviroses et viroses apparentées. Un laboratoire de haute sécurité rénové assurera, dès juin 2000, une structure indispensable à la poursuite des missions de veille et d’expertise des maladies virales émergentes.

Mise au point de techniques

(H. Zeller, B. Murgue, V. Deubel, M. Bouloy, A. Billecocq, C. Prehaud, D. Coudrier, S.Murri)

Le CNR produit et distribue les réactifs nécessaires au diagnostic des principales arboviroses. Il travaille à l’amélioration des techniques et au transfert de celles-ci par l’accueil de stagiaires venant principalement de pays tropicaux. Il dispose d’une collection de plusieurs centaines de souches représentant 56 arboviroses et virus des fièvres hémorragiques différents. Nous avons développé le diagnostic sérologique des principales arboviroses par capture d’IgM. Notre découverte du virus Ebola en Côte d’Ivoire et au Gabon en 1994 nous a amenés à nous intéresser tant au diagnostic des infections aiguës (IgM, PCR, capture d’antigène) qu’aux études de prévalence du portage d’anticorps. Les protéines recombinantes NP et VP40 de la souche gabonnaise de 1994 du virus Ebola ont été exprimées dans E. coli et purifiées. La GP de la même souche a été exprimée dans des cellules de mammifères à l’aide du replicon derivé du virus de la forêt de Semliki. Utilisées dans un test Elisa, elles permettent de révéler la présence d’anticorps chez les malades ou dans des échantillons prélevés pour des enquêtes visant à évaluer la circulation du virus. Le diagnostic des affections liées aux hantavirus présents en France repose sur la sérologie. Par contre, l’étude de la distribution des souches chez les rongeurs a nécessité le développement d’une technique de PCR. Les protéines d’enveloppe des 4 sérotypes de la dengue ont été produites par le système du baculovirus et purifiées. Elles sont utilisées pour la détection d’IgG et d’IgM. Une trousse de diagnostic préparée par Sanofi-Diagnostic Pasteur pour le diagnostic de la dengue fait l’objet d’une validation dans le réseau des Instituts Pasteur.

Epidémiologie

(B. Murgue, H. Zeller, V. Deubel, D. Coudrier, S. Murri)

La fièvre hémorragique avec syndrome rénal, affection due à des Hantavirus, est présente principalement dans le quart Nord Est de la France. Une enquête cas/témoins a permis de préciser les facteurs de risque, en particulier de prouver que le campagnol roussâtre, réservoir du virus pénètre dans les habitations situées en lisière de forêt. Le cycle épidémique de cette maladie est directement lié à la dynamique des populations du réservoir. Après les épidémies triennales de 1993 et de 1996, une augmentation sensible du nombre de cas de FHSR a été observée en 1999. Le Centre exerce une activité de surveillance des arboviroses d’importation. La dengue est l’affection la plus courante. Le nombre de cas croit régulièrement en zone tropicale, en particulier dans les Caraïbes. Cette maladie est désormais courante chez les touristes. Dans notre rôle de Centre collaborateur OMS, nous avons diagnostiqué et participé au suivi de plusieurs épidémies dues au virus West-Nile, un arbovirus transmis d’oiseaux au cheval et à l’homme par des moustiques du genre Culex : au Maroc et en Roumanie en 1996, en Tunisie en 1997 puis en Italie en 1998. Ces épidémies font craindre la réapparition de cette maladie dans le sud de la France. Par ailleurs, une épidémie de fièvre hémorragique due au virus Marburg continue à sévir en République Démocratique du Congo et notre équipe du CNR participe à la capture de chauve-souris suspectées d’être un des réservoirs du virus.

Diagnostic et épidémiologie moléculaire

(H. Zeller, B. Murgue, V. Deubel, M. Bouloy, D. Coudrier, M.T. Drouet, S. Murri)

Plusieurs techniques de diagnostic rapide (RT-PCR) et de caractérisation génétique par séquençage des souches d’arbovirus et virus des fièvres hémorragiques (Hantavirus, Ebola, FVR, dengue, West Nile, fièvre jaune) ont été mises au point et développées au CNR. Plusieurs de ces études sont réalisées dans le cadre de collaborations avec le Réseau international des Institut Pasteur et Instituts associés. Des séquences du virus Ebola proches du génotype Zaïre/Gabon ont été identifiées dans les organes de petits mammifères de République Centrafricaine, suggérant que ces animaux ont été en contact avec le virus. (Collaborations : J. Morvan, M. Colin, V. Volchkov)

Mots-clés : Replication, interactions virus cellules, virulence, pathogénèse, épidémiologie moléculaire, diagnostic.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

BADELLA Jacqueline – Tél : (33) 01 40 61 35 15 MEIGNAN Marie-Laurence - Tél : (33) 01 40 61 35 15 MILLIOT Brigitte - Tél : (33) 01 40 61 31 45

Chercheurs de l'unité

BILLECOCQ Agnès
BOULOY Michèle
DESPRES Philippe
DEUBEL Vincent
FLAMAND Marie
MURGUE Bernadette
PREHAUD Christophe
ZELLER Hervé

Stagiaires de l'unité

ALCON Sophie - DEA
COULIBALY Fasséli - DEA
COURAGEOT Marie-Pierre - Thèse
KOHL Alain - Thèse
SALL Amadou - Thèse
YADANI Fatima - Thèse

Autre personnel de l'unité

COUDRIER Daniel - Technicien
DROUET Marie-Thérèse - Technicien
FRENKIEL Marie-Pascale - Technicien
MEGRET Françoise - Ingénieur
MURRI Séverine - Technicien
VIALAT Pierre - Technicien

Publications de l'unité

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