Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Virologie Immunologie Cellulaire

CNRS URA 1930


Responsable : HOVANESSIAN Ara (arahovan@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Les mécanismes impliqués dans la pathogénie du SIDA en relation avec l'infection par le virus d'immunodéficience humaine, VIH, sont étudiés. Par ailleurs l'infection virale conduit à la production d'interféron, qui joue le rôle de première barrière contre l'extension de la virémie. Dans cette optique, les principales lignes de recherche sont les suivantes : 1) développement des inhibiteurs de l'entrée du VIH, 2) étude des composants à la surface cellulaire impliqués dans le processus d'accrochage des particules virales aux cellules permissives, 3) le rôle de CD26 dans l'infection par le VIH, 4) l'apoptose médiée par l'infection du VIH, 5) clonage et caractérisation des 2'-5' oligoadenylate synthétase (2-5A synthétase), 6) caractérisation des différentes fonctions de la protéine kinase PKR induite par l'interféron.

Abstract

In order to clarify the mechanisms implicated in AIDS pathogenesis in relation to HIV infection, the members of this unit have concentrated their studies on the different steps in the HIV infectious cycle, and particularly on the viral entry process. As interferon protects cells against virus infections, studies are carried out in order to understand its mechanism of action. In this respect, the major lines of research are: 1) development of inhibitors of HIV entry, 2) characterization of cell-surface components implicated in the attachment of HIV particles to permissive cells, 3) The role of CD26 in HIV infection, 4) HIV-mediated apoptosis, 5) cloning and characterization of 2'-5' oligoadenylate synthetases (2-5A synthetase), 6) characterization of the different functions of the interferon-induced protein kinase PKR.

Texte du rapport

La boucle V3 est nécessaire à la fixation des particules du VIH aux cellules cibles. (A. Hovanessian)
Précédemment, plusieurs équipes ont souligné le rôle critique du domaine V3 de la gp120 en relation avec les récepteurs des chimiokines. Nous avons démontré que le domaine V3 est également nécessaire à la fixation des particules virales aux cellules exprimant le récepteur CD4. Ainsi, des anticorps spécifiques pour V3, en se fixant sur les particules virales, empêchent leur accrochage aux cellules suggérant l'existence de récepteur(s) pour la boucle V3. Les chimiokines ou des inhibiteurs se fixant sur des récepteurs de chimiokines inhibent l'entrée du VIH sans affecter l'accrochage des particules virales, suggérant ainsi que les récepteurs de chimiokines bien qu'essentiels pour la fusion membranaire ne sont pas impliqués dans le processus de l'accrochage des particules virales aux cellules permissives.

5[K(psi)PR]-TASP est un inhibiteur spécifique de l'entrée du VIH. (C. Callebaut, B. Krust, S. Nisole, S. Loaec, N. Seddiki, A. Hovanessian) Cette construction a été définie après le motif dipeptidique RP conservé dans la boucle V3 des isolats des VIH. Nous avons démontré que ce pseudopeptide inhibe l’infection des cultures primaires des lymphocytes T et des macrophages par les divers isolats de VIH. Il est actif contre les VIH-1 et VIH-2, mais inactif dans le cas du SIV. De plus, ce pseudopeptide n'a pas d'effet sur les VIH-1 pseudotypés avec des glycoprotéines d'enveloppe du VSV ou MoMLV, démontrant ainsi qu'il est dirigé contre l'infection médiée par les glycoprotéines d'enveloppe du VIH. Cet inhibiteur spécifique pour le VIH étant extrêmement stable dans le plasma humain il représente un candidat de choix pour des essais thérapeutiques contre le VIH. (K=lysine, P=proline, R=arginine.)

Étude de la cible de l'inhibiteur 5[K(psi)PR]-TASP. (C. Callebaut, S. Nisole, B. Krust, A. Hovanessian) Le pseudopeptide 5[K(psi)PR]-TASP (nommé HB-19) bloque l'accrochage des particules virales aux cellules en formant un complexe avec une protéine de 95 kDa à la surface cellulaire. Cette protéine a été isolée et identifiée comme étant la nucléoline. En utilisant différentes approches expérimentales, notamment microscopie électronique et confocale, nous avons confirmé que la nucléoline est bien exprimée à la surface cellulaire où elle se conduit comme une protéine intégrale de la membrane plasmique. Des préparations partiellement purifiées de la nucléoline, dépourvues du CD4 ou CXCR4, ont été démontrées avoir une forte affinité pour la gp120; cette fixation de la gp120 avec la nucléoline est inhibée par des anticorps neutralisants spécifiques pour la boucle V3 mais pas des anticorps dirigés contre le site d'accrochage à CD4. Ces résultats suggèrent que la boucle V3 est responsable de l'interaction des particules du VIH avec des composants cellulaires.

Étude des récepteurs potentiels de la boucle V3. (C. Callebaut, S. Nisole, B. Krust, A. Hovanessian) En utilisant des préparations partiellement purifiées de la nucléoline (dépourvues de CD4 et CXCR4) nous avons démontré que le pseudopeptide 5[K(psi)PR]-TASP (nommé HB-19) se fixe avec une haute affinité. Cette fixation de HB-19 à la nucléoline est inhibée par des anticorps anti-boucle V3. Nous avons suggéré que la nucléoline de surface sert de récepteur potentiel de la boucle V3 et de ce fait, joue un rôle essentiel pour la fixation des particules du VIH aux cellules permissives. En accord avec cette suggestion, nous avons démontré d'une part que des anticorps neutralisants spécifiques de la boucle V3 se fixent aux particules virales et empêchent leur accrochage à la nucléoline de surface et, d'autre part l'inhibiteur 5[K(psi)PR]-TASP en se fixant à la nucléoline de surface empêche l'accrochage des particules virales aux cellules permissives. L'implication de la nucléoline comme un récepteur pour la boucle V3 est renforcée par l'observation selon laquelle les particules virales peuvent entrer en compétition avec l'inhibiteur 5[K(psi)PR]-TASP en empêchant sa fixation avec la nucléoline de surface.

Implication de CD26 comme co-facteurs au CD4 dans l'infection par le VIH. (B. Krust, C. Callebaut)
Nos résultats montrent que CD26 joue un rôle déterminant dans les différentes fonctions complexes des glycoprotéines d'enveloppe gp120/gp41 du VIH, l'entrée virale, la formation de syncytia et l'induction de l'apoptose. Nous avons établi des clones cellulaires humains (CEM) exprimant différents niveaux de CD26: CD26 Low, CD26 High, CD26 Super -High et des clones exprimant l'ADNc CD26 inversé. Pour chaque type, nous avons analysé sur plusieurs clones la cinétique d'infection virale par la synthèse d'ADN proviral et par la production du virus; ceci pour déterminer la cinétique d'entrée du virus. Le processus d'infection viral est réduit de 48h dans des clones CEM CD26 High par rapport aux cellules CEM CD26 Low et CEM CD26 Super High. Ainsi ces expériences ont révélé que les clones des cellules CEM CD26 Super High ont un phénotype identique à celui des celles CEM CD26 Low, cela montre qu'une expression trop forte de CD26 entraîne une entrée retardée suggérant une perturbation de l'organisation des composants membranaires. Par ailleurs, l'infection par VIH a été très faible avec un retard significatif dans une dizaine de clones exprimant l'ADNc CD26 inversé (3'5') (montrant une absence d'expression de CD26 endogène).

Isolation et caractérisation du virus de l'immunodéficience simien chez les singes mangabeys. (M.A. Rey-Cuillé)
Une étude sérologique effectuée sur des mangabeys en captivité dans des zoos en France a permis d'identifier trois singes infectés par le SIV. Les trois isolats viraux ont été cultivés in vitro ce qui a permis leur caractérisation. Des séquences nucléotidiques de la région gag et env ont été déterminées.

Étude du mode d'action de deux enzymes induites par l'Interféron et dépendantes d'ARN bicaténaire. (A. Hovanessian, I. Marié, E. Meurs)
Parmi les gènes induits par l'interféron, nous étudions la fonction de la 2-5A synthétase et la PKR (Protein Kinase dsRNA Regulated), deux enzymes activées par l'ARN bicaténaire et/ou par un ARN monocaténaire de structure secondaire en épingle à cheveux. Ces enzymes régulent le métabolisme cellulaire et jouent un rôle important dans l’action antivirale de l’interféron. Les travaux se poursuivent pour préciser leurs fonctions.

Clonage des 2-5A synthétases de 69 et 100 kDa. (I. Marié, D. Rebouillat, A. Hovanessian) Les 2-5A synthétases appartiennent à une famille multigénique de protéines de 40-46, 69 et 100 kDa. Le gène codant pour les protéines p40-46 a été cloné par différents groupes. Nous avons réalisé le clonage et la caractérisation de plusieurs ADNc apparentés à la 2-5A synthétase p69 et le clonage de la p100 vient d'être réalisé. L'ADNc complet codant pour p100 code pour une phase ouverte de lecture constituée de 1083 acides aminés générant une protéine de poids moléculaire théorique: 120 kDa, en accord avec le poids moléculaire apparent de 100 kDa observée pour p100. L'analyse de la séquence de cette phase ouverte de lecture démontre que p100 est structurée en trois domaines homologues les uns aux autres et homologues au domaine synthétase "classique" correspondant à la 2-5A synthétase humaine de 40 kDa. Chacun des domaines contient également les signatures peptidiques spécifiques de la famille des 2-5A synthétases, constitués de motifs peptidiques ultraconservés et correspondant aux motifs catalytiques et à des motifs de fixation de cofacteurs comme l'ARN bicatenaire.

Etude de l'activité catalytique des 2-5A synthétases de 69 et 100 kDa. (I. Marié, D. Rebouillat, A. Hovanessian) En utilisant des protéines purifiées, nous avons démontré que ces deux formes de synthétases pouvaient être différenciées par des paramètres d'activation et leur pouvoir de synthèse d'oligomères de 2-5A. Par ailleurs, nous avons démontré que GTP pourrait être un substrat ultérieur de ces enzymes.

Clonage d'une protéine de 56 kDa homologue à la 2-5A synthétase. (D. Rebouillat, A. Hovanessian)
Nous avons isolé un ADNc codant pour une protéine de 56 kDa induite par l'interféron. La séquence en acides aminés de cette protéine est fortement homologue à celle des 2-5A synthétases 40-46, 69 et 100 kDa. En revanche, cette protéine ne semble pas posséder la capacité de synthétiser du 2-5A. La protéine 56 kDa a une localisation cytoplasmique et nucléolaire.

Définition d'un cluster de gènes regroupant les gènes des 2-5A synthétases humaines de 40 /46, 69/71, et 100 kDa. (D. Rebouillat, A. Hovanessian, I. Marié) En collaboration avec Marie-Geneviève Mattéi à la Faculté de Médecine de la Timone à Marseille nous avons montré que les gènes codant pour les trois formes de 2-5A synthétase humaine identifiées sont localisés sur le chromosome 12 au niveau de la bande q24.2. La répartition exacte et l'ordre de ces gènes de cette région du chromosome 12 a été ensuite étudiée en collaboration avec l'équipe d'Alain Hovnanian et Anthony Monaco à l'Université d'Oxford (The Wellcome Trust Center for Human Genetics), en utilisant des YACs et des PACs recouvrant cette région chromosomique. Nous avons ainsi démontré que les trois gènes de la 2-5A synthétase sont regroupés dans une région de 130 kb sur le chromosome 12 bande q24.2 par l'ordre suivant : cen - p40/p46 - p100 - p69/p71 - tel constituant le locus de la 2-5A synthétase. Par ailleurs, le gène codant les protéines apparentées 30 et 56 kDa est localisé en dehors de ce locus mais toujours sur le chromosome 12q24.2 à une distance d'au moins 1 Mb telomerique du gène de la 2-5A synthétase 69/71 kDa. La démonstration d'une augmentation croissante de la complexité des 2-5A synthétases, allant de p40/p46 (1 domaine) à p100 (3 domaines) en passant par p69/p71 (2 domaines), ainsi que la mise en évidence d'un cluster réunissant les gènes codant pour ces protéines, suggèrent une évolution commune des 2-5A synthétases à partir d'un gène ancestral certainement composé d'un domaine 2-5A synthétase.

Mécanisme d'action antivirale et antitumorale de la PKR. (E. Meurs, M. Bonnet)
La PKR a des propriétés antivirales et de suppresseur de tumeur. Différents inhibiteurs de la PKR produits au cours d'infections virales, peuvent contrecarrer son action. Des études sont entreprises sur les interactions de la PKR avec certains de ces inhibiteurs (TRBP, dans le cas de l'infection par VIH-1 et NS5A dans le cas de l'infection par l'Hépatite C) afin de renforcer les propriétés antivirales et antitumorales de la PKR.

Mécanisme d'action de la PKR dans la signalisation cellulaire. (E. Meurs, M. Bonnet, B. Magun)
La PKR aussi impliquée dans des mécanismes de signalisation qui restent encore à déterminer, notamment si cette fonction nécessite son activité kinase. A l'aide d'un microtest fonctionnel de la PKR en cellules de mammifères et de différents mutants de la PKR, nos recherches ont démontré que la PKR, indépendamment de son activité kinase, peut activer des gènes sous le contrôle du LTR du VIH. Cette stimulation par la PKR implique l'activation des NF-kB. Notre hypothèse est que la PKR, en tant que protéine, peut interagir avec des facteurs cellulaires conduisant à l'activation de NF-kB.

Phosphoprotéines nucléaires induites par l'interféron. (E. Meurs, G. Welsh)
Les études sont poursuivies pour déterminer la fonction de deux phosphoprotéines nucléaires induites par l'interféron, clonées au laboratoire. Ces protéines ont des signatures communes avec d'autres protéines nucléaires (SP100 et suppressine). Elles sont très homologues, divergent à leurs extrémités et n'interagissent pas directement entre elles. Elles sont localisées respectivement dans le nucléole et le nucléoplasme et colocalisent à l'anneau externe du nucléole, lieu de synthèse des rARNs.

Mots clés : HIV, interféron, nucléoline, pseudopeptide, 2-5A synthétase, protéine kinase PKR.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

JEWIARZ Danielle, IP djewiarz@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

HOVANESSIAN Ara, CNRS arahovan@pasteur.fr KRUST Bernard, INSERM bkrust@pasteur.fr MARIE Isabelle, IP (post-doc USA)
MEURS Éliane, IP emeurs@pasteur.fr
REY-CUILLE Marie-Anne, CNRS (post-doc USA)

Stagiaires de l'unité

BONNET Marion, Thèsard
CALLEBAUT Christian, Post-Doc
MAGUN Bruce, Prof. année sabbatique
NISOLE Sébastien, Thèsard
REBOUILLAT Dominique, Post-Doc
SEDDIKI Nabila, Post-Doc
WELSH Gavin, Post-doc

Autre personnel de l'unité

LOAEC Solen, IP
ROBERT Nadine, IP
SVAB Josette, CNRS

Publications de l'unité

98189150
98216750
98285675
98303810
98371040
98430977
99009311
99041549

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