Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Venins


Responsable : BON Cassian (cbon@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Les venins, notamment les venins de serpent, sont des mélanges complexes de protéines (plus d'un millier dans un même venin) qui chacune possède une activité biologique spécifique : toxine pour tuer la proie, enzyme hydrolytique pour en faciliter la digestion, protéine capable de perturber gravement le métabolisme de la proie ou de l'agresseur, etc. Cette complexité des venins rend difficile le traitement des envenimations dont le seul remède spécifique reste l'immunothérapie antivenimeuse. D'un autre point de vue, les venins sont aussi une source exceptionnelle de protéines utiles pour étudier des fonctions biologiques diverses. Ainsi l'Unité des Venins se consacre aux aspects médicaux concernant les envenimations et leur traitement par immunothérapie, et à l'étude des venins de serpent comme source d'outils pharmacologiques et de modèles pour le développement d'agents de diagnostic ou thérapeutiques utilisables en neurobiologie et/ou en hémostase.

Abstract

Venoms, particularly snake venoms, are complex mixtures of proteins (more than one thousand in the same venom) each one of which possesses a specific biological activity: toxic substances to kill the prey, hydrolytic enzymes to digest it, biologically active proteins able to seriously damage the metabolism of the prey or of the agressor, etc. This complexity makes the treatment of envenomations very difficult, with immunotherapy being the unique specific antidote. On the other hand, venoms are an exceptionally rich source of useful proteins to study various biological functions. The Unité des Venins is concerned by the clinical aspects of the envenomations and their treatment by immunotherapy, and by the study of snake venom components as pharmacological tools or molecular models in the development of therapeutic agents in the fields of neurobiology and haemostasis.

Texte du rapport

IMMUNOTHERAPIE ANTIVENIMEUSE
(V. Choumet, E. Ferquel, M. Naviner, A. Robbe-Vincent)

La sérothérapie antivenimeuse est le seul traitement spécifique des envenimations. Bien que très utilisée, notamment dans les pays tropicaux, elle est souvent contestée en France du fait du manque d'études bien contrôlées prouvant son efficacité et établissant rigoureusement ses conditions d'utilisation. Une vaste étude des envenimations vipérines en France a permis de rassembler les données cliniques et biologiques concernant plus de cent cinquante cas d'envenimations. Celle-ci a été complétée par une étude expérimentale chez le lapin de la toxicocinétique du venin en absence et après immunothérapie antivenimeuse. Ces travaux ont montré que le venin de vipère est rapidement absorbé à partir du site d'injection, qu'il diffuse largement dans l'organisme mais qu'il est éliminé lentement en absence d'immunothérapie. Comme cela est attendu, la gravité des envenimations croit avec la quantité de venin présente dans le sang des patients. L'administration du sérum antivenimeux provoque une redistribution du venin depuis les tissus vers le compartiment vasculaire, où les antigènes toxiques sont neutralisés par les anticorps puis éliminés. Ces résultats ont conduit les médecins français à reconsidérer leur position négative vis-à-vis du sérum antivenimeux et à l'utiliser à nouveau dans des conditions plus rigoureuses avec pour conséquence une réduction très importante de la mortalité, de la morbidité et de la durée d'hospitalisation. D'autres types d'envenimations, notamment par le serpent Fer de Lance de la Martinique et par les scorpions du Maghreb et du Mexique, sont en cours d'étude avec une méthodologie semblable.

NEUROBIOLOGIE DES TOXINES DE VENINS
(V. Choumet, G. Faure, J. Mary)

Certaines neurotoxines de venin de serpent, comme la crotoxine du Crotale sud-américain, possèdent une activité phospholipase A2 (PLA2) et bloquent la transmission neuromusculaire. La crotoxine est constituée d'une PLA2 basique faiblement toxique (CB) associée de manière non covalente à une protéine acide non toxique et dépourvue d'activité catalytique (CA). L'affinité de l'interaction entre les deux sous-unités joue un rôle essentiel dans l'action pharmacologique de la crotoxine. En particulier, les complexes CACB les plus affins sont les plus toxiques, la sous-unité CA s'associe à certaines PLA2 neurotoxiques homologues à CB et augmente leur toxicité, et un anticorps monoclonal anti-CA neutralise la crotoxine in vitro et in vivo en dissociant le complexe CACB. Sur un autre plan, des expériences de liaison ont montré que la crotoxine se lie avec une affinité élevée à une protéine de la membrane des synaptosomes d'organes électriques de Torpille. L'association CACB-récepteur est instable et le complexe se dissocie, la sous-unité CB restant associée au récepteur. La caractérisation du récepteur de la crotoxine a été entreprise et une protéine de 48 kDa a été radiomarquée au cours d'expériences de "cross-linking". Enfin, un inhibiteur naturel de la crotoxine a été caractérisé dans le sérum de crotale.

Une étude de l'acétylcholinestérase (AChE) de venin de serpent a aussi été entreprise. Par comparaison avec les formes moléculaires des tissus nerveux et musculaires, les AChEs de venins de serpent sont des enzymes monomériques solubles non amphiphiles, ce qui facilite leur utilisation pour des études enzymologiques, biochimiques et structurales. L'existence d'un moment dipolaire sur l'AChE du venin de bungare a ainsi été démontrée physiquement. Ce moment dipolaire pourrait guider l'acétylcholine, qui est un substrat chargé, vers son site catalytique et augmenter la vitesse de catalyse de l'enzyme. Par ailleurs, le gène de l'AChE de bungare a été cloné et séquencé. Il a été montré que la forme monomère et soluble du venin est due à l'expression d'un nouvel exon alternatif. Sur le plan pratique, il a été tiré avantage des propriétés de l'AChE de bungare pour mettre au point un procédé très commode pour préparer des immunconjugués en associant par recombinaison génétique cette enzyme à un scFv.

VENINS ET HEMOSTASE
(S. Braud, C. Lecut, M. Leduc, W.H. Lee, R. Maroun, C. Mounier, B. Saliou, A. Wisner)

De nombreux composés issus de venins de serpent exercent des effets activateurs ou inhibiteurs sur les mécanismes hémostatiques. Plusieurs d'entre eux ont ainsi été caractérisés à partir de différents venins : la convulxine, un activateur plaquettaire ; la bothrojaracine, un inhibiteur de la thrombine ; et le TSV-PA, un activateur du plasminogène. La convulxine, extraite du venin d'un crotale brésilien, active les plaquettes sanguines en se liant spécifiquement avec une affinité élevée sur la glycoprotéine VI (GPVI) connue pour être l'un des principaux récepteurs du collagène. Ainsi la convulxine, dont les deux sous-unités ont été clonées et séquencées, apparaît être un outil précieux pour identifier, purifier et caractériser la GPVI, une molécule clef de l'activation des plaquettes sanguines. La bothrojaracine, découverte dans le venin de Bothrops jararaca, est un inhibiteur spécifique et puissant de la thrombine humaine. Son mécanisme d'action est original puisqu'elle interagit avec les exosites I et II, nécessaires à l'interaction de la thrombine avec ses substrats macromoléculaires (fibrinogène, récepteurs plaquettaires, thrombomoduline ...) et ses inhibiteurs physiologiques (antithrombine III et l'héparine), sans affecter le site catalytique de cette enzyme. Après avoir cloné et séquencé les ADNc codant les sous-unités de la bothrojaracine, celle-ci a été exprimée sous une forme recombinante active et une étude par mutagénèse dirigée de l'interaction bothrojaracine-thrombine a été entreprise afin de rechercher des agents antithrombotiques originaux. Un activateur spécifique du plasminogène, le TSV-PA, a été identifié dans le venin du serpent chinoisTrimeresurus stejnegeri. Cet activateur est insensible aux inhibiteurs physiologiques. Il pourrait donc s'avérer être un agent thrombolytique intéressant pour le traitement des accidents cardiovasculaires. L'ADNc codant le TSV-PA a été cloné, séquencé puis exprimé chez E. coli. Le TSV-PA recombinant possède toutes les propriétés de l'activateur naturel du venin. Sa structure tridimensionnelle, établie par modélisation moléculaire, a été confirmée par cristallographie.

Il a enfin été montré que la PLA2 humaine de type II (sPLA2grII), sécrétée par les plaquettes sanguines au cours de leur activation, possède une action inhibitrice sur la coagulation plasmatique. La sPLA2grII exerce donc un rétrocontrôle négatif à l'action procoagulante des plaquettes activées. Cette boucle de régulation ouvre des perspectives importantes pour une meilleure compréhension des mécanismes de l'hémostase et leur régulation. En ce qui concerne le mécanisme d'action de la sPLA2grII, il a été démontré que son action anticoagulante n'implique pas son activité enzymatique mais une action directe avec le facteur Xa de la coagulation. Une étude moléculaire par mutagénèse dirigée et une étude comparative avec les PLA2 anticoagulantes des venins de serpent a permis d'identifier une des régions de la sPLA2grII humaine responsables de son action anticoagulante. Des peptides réalisés à partir de cette région pourraient servir de modèles moléculaires pour la mise au point d'agents antithrombotiques originaux.

Mots clés : Venin, envenimation, immunothérapie, neurotoxines, hémostase, phospholipase A2, protéinase à sérine.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

COUEILLE Solange, IP, coueille@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

CHOUMET Valérie, IP, vchoumet@pasteur.fr FAURE Grazyna, IP, fgrazyna@pasteur.fr
LEDUC Mireille, Université Paris XI, mleduc@pasteur.fr MAROUN Rachid, INSERM, rmaroun@pasteur.fr MOUNIER Carine, Université Cergy-Pontoise, cmounier@pasteur.fr

Stagiaires de l'unité

BRAUD Sandrine, Thèse, sbraud@pasteur.fr DOMINGUEZ DEL ANGEL Victoria, Thèse, victoria@pasteur.fr LECUT Christelle, DEA, clecut@pasteur.fr LEE Wen-Hui, Post-doctorant
MARY Jean, Post-doctorant, jmary@pasteur.fr NAVINER Magali, Thèse, mnaviner@pasteur.fr

Autre personnel de l'unité

DAMATRIN René, IP
Dr FERQUEL Elisabeth, IP, eferquel@pasteur.fr ROBBE-VINCENT Annie, IP, arobbe@pasteur.fr SALIOU Bernard, IP, bsaliou@pasteur.fr
WISNER Anne, IP, awisner@pasteur.fr

Publications de l'unité

98189213. Pungercar, J., Vucemilo, N., Faure, G., Bon, C., Verheij, H.M., Gubensek, F. & Krizaj, I. (1998) Ammodytin L, an inactive phospholipase A2 homologue with myotoxicity in mice, binds to the presynaptic acceptor of the b-neurotoxic ammodytoxin C in Torpedo: an indication for a phospholipase A2 activity-independent mechanism of action of b-neurotoxins in fish? Biochem. Biophys. Res. Comm., 244, 514-518.

98212017. Cousin, X., Bon, S., Massoulié, J. & Bon, C. (1998) Identification of a novel type of alternatively spliced exon from the acetylcholinesterase gene of Bungarus fasciatus. Molecular forms of acetylcholinesterase in the snake liver and muscle. J. Biol. Chem., 273, 9812-9820.

98220419. Shin, I., Silman, I., Bon, C. & Weiner, L. (1998) Liposome-catalyzed unfolding of acetylcholinesterase from Bungarus fasciatus. Biochemistry, 37, 4310-4316.

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98395088. Mounier, C.M., Hackeng, T.M., Schaeffer, F., Faure, G., Bon, C. & Griffin, J.H. (1998) Inhibition of prothrombinase by human secretory phospholipase A2 involves binding to factor Xa. J. Biol. Chem., 273, 23764-23772.

98411371. Arbibe, L., Koumanov, K, Vial, D., Rougeot, C., Faure, G., Havet, N., Longacre, S., Vargaftig, B.B., Béréziat, G., Voelker, D.R., Wolf, C. & Touqui, L. (1998) Generation of lyso-phospholipids from surfactant in acute lung injury is mediated by type-II phospholipase A2 and inhibited by a direct surfactant protein A-phospholipase A2 protein interaction. The Journal of Clinical Investigation, 102, 1152-1160.

98428674. Parry, M.A.A., Jacob, U., Huber, R., Wisner, A., Bon, C. & Bode, W. (1998) The crystal structure of the novel snake venom plasminogen activator TSV-PA: a prototype structure for snake venom serine proteinases. Structure, 6, 1195-1206.

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