Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Recombinaison & Expression Génétique

INSERM U.163


Responsable : TIOLLAIS Pierre (tiollais@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L'Unité de Recombinaison et Expression Génétique effectue des recherches sur l'oncogénèse, la virologie moléculaire et le vaccin recombinant contre l'hépatite B. Le virus de l'hépatite B (HBV) peut engendrer un cancer du foie et il est par conséquent très important d'élucider les mécanismes par lesquels ce virus provoque ce cancer. Sur un modèle animal, la marmotte, nous avons montré que le virus de l'hépatite de la marmotte induit le cancer du foie en s'insérant à proximité d'un gène myc. Nous précisons également le rôle potentiel de la protéine virale régulatrice HBx dans le processus de cancérisation. Notamment, nous étudions les perturbations engendrées par les interactions entre la protéine virale et des protéines de la cellule hôte. Nous étudions d'autre part l'importance de l'apoptose dans le développement de l'hépatocarcinome. Nous portons aussi nos efforts pour comprendre les mécanismes moléculaires de l'oncogénèse hépatique chez l'homme. Nous cherchons à identifier des gènes suppresseurs de tumeur impliqués dans ce type de cancer. Notre laboratoire étudie également le rôle des protéines PML, RAR-alpha et PML-RAR-alpha dans la leucémie aiguë à promyélocytes. Nous avons également initié des travaux sur le virus de l'hépatite C dont on connaît mal le mécanisme de réplication, en vue de préciser les partenaires viraux et cellulaires de la polymérase virale. Nous participons à un protocole de vaccinothérapie des porteurs chroniques du virus de l’hépatite B basé sur l’utilisation du vaccin recombinant actuel. Nous avons mis au point un vaccin génétique anti-hépatite B basé sur l’utilisation de vecteurs ADN codant pour les protéines d’enveloppe du virus. Ce vaccin induit des réponses humorales et cellulaires chez la souris et le primate et pourrait représenter une nouvelle approche pour le traitement des porteurs chroniques du virus HBV. L’antigène HBs est également utilisé comme système de présentation d’épitopes hétérologues.

Abstract

The "Unité de Recombinaison et Expression Génétique" conducts research on oncogenesis, molecular virology and hepatitis B recombinant vaccine. The hepatitis B virus (HBV) can induce liver cancer and it is therefore very important to understand the mechanisms underlying this viral oncogenesis. In an animal model, the woodchuck, we have shown that the woodchuck hepatitis virus induces liver cancer after integration near a myc gene. We are also investigating the potential role of the regulatory viral protein HBx in the oncogenic process and the interactions of this protein with host cellular proteins. Moreover, we study the importance of apoptosis in the development of hepatocarcinoma. In an effort to understand the molecular basis of liver oncogenesis in humans : we are trying to identify tumor suppressor genes involved in this cancer. Our laboratory is also studying the role of the PML, RAR-alpha and PML-RAR-alpha oncogenic proteins in promyelocytic acute leukemia. We have also initiated research on hepatitis C virus. The replication mechanism of this virus is poorly understood and we are therefore attempting to elucidate the viral and cellular partners of the viral polymerase. We participate in a vaccinotherapy trial of HBV chronic carriers using the recombinant vaccine in collaboration with Professor C. Brechot. We have developed a genetic vaccine against hepatitis B. The DNA vectors used code for the envelope proteins of the virus. The DNA vaccine induces both humoral and cellular response in mice and primates. It could represent a new approach to treat HBV chronic carrier patients. The HBs antigen is also used as a system to present heterologous epitopes.

Texte du rapport

Relation entre les virus d’hépatites B (HBV) et C (HCV) et leur cellule hôte (Catherine TRANSY)
Les traitements actuellement disponibles pour les patients souffrant d'hépatite B ou C montrent une efficacité limitée. Une analyse détaillée des interactions moléculaires mises en jeu par HBV et HCV au cours de leur cycle viral pourrait permettre de définir de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou d'améliorer l'efficacité des médicaments utilisés . La protéine régulatrice HBx du virus HBV est indispensable à l'établissement de l'infection bien que son rôle précis n'ait pas été identifié. En créant des lignées cellulaires exprimant HBx de manière constitutive, nous avons mis en évidence une activité proapoptotique de la protéine située en aval de son activité transactivatrice de la transcription. Par ailleurs, nos résultats récents indiquent que l'interaction entre HBx et la protéine cellulaire UVDDB est cruciale, non seulement pour l'activité transactivatrice, mais aussi pour le potentiel infectieux du virus. Cette interaction pourrait donc s'avérer une cible pour le développement d'inhibiteurs anti-viraux et nous examinons actuellement cette possibilité. En raison de l'absence de système cellulaire permettant de propager le virus HCV in vitro, on connaît mal la nature et la fonction des interactions entre les protéines virales matures, qui dérivent de la protéolyse d'un précurseurs unique. En collaboration avec le laboratoire LMA (Institut Pasteur) nous avons développé une approche double-hybride basée sur l'utilisation d'une banque codant pour des domaines aléatoires de la polyprotéine virale. Nous avons ainsi pu révéler des interactions déjà connues ainsi que d'autres, encore non décrites. Deux de ces interactions impliquent les protéases virales et notre objectif est maintenant de rechercher des modulateurs de ces interactions se comportant comme des inhibiteurs des protéases virales.

Virus de l'hépatite B et hépatocarcinome (Marie Annick BUENDIA)
Bien qu'une relation causale ait été clairement établie entre l'infection chronique par le virus de l'hépatite B (HBV) et le développement du cancer du foie, le rôle précis de ce virus dans le processus tumoral reste mal connu. Dans le modèle de la marmotte infectée par un hepadnavirus (WHV) étroitement apparenté à l'HBV, nous avons démontré un rôle direct de l'intégration virale dans l'activation oncogénique des gènes c-myc et N-myc. L'analyse structurale et fonctionnelle des enhancers du virus WHV a permis de définir les éléments essentiels à l'activation en cis des promoteurs des gènes myc. Nous avons démontré le fort potentiel oncogénique de l'expression de Myc sous contrôle des enhancers viraux dans des lignées de souris transgéniques qui récapitulent des différentes étapes de l'hépatocarcinogénèse viro-induite. Ces modèles transgéniques ont par ailleurs permis de mettre en évidence un rôle de promoteur de tumeur pour le gène régulateur X de l'HBV. Nos études ont montré que la protéine transactivatrice HBX exerce une fonction pro-apoptotique dans les cellules hépatiques in vivo et in vitro, indépendamment de la présence d'un gène p53 fonctionnel, et que cette fonction est capable de bloquer l'effet anti-apoptotique de Bcl-2. Le rôle de la protéine X dans l'hépatocarcinogénèse est aussi abordé par l'étude de son activité transactivatrice et de sa capacité à déréguler le cycle cellulaire dans des modèles d'hépatocytes bien différenciés.

Mécanismes moléculaires de l'oncogénèse hépatique (Marie Annick BUENDIA)
Nous étudions les événements moléculaires de la transformation des cellules hépatiques chez l'homme et dans des modèles transgéniques murins. Afin d'identifier des gènes suppresseurs de tumeur impliqués dans l'hépatocarcinogénèse, nous étudions les régions chromosomiques montrant de fréquentes pertes alléliques sur les chromosomes 1 et 16 dans l'hépatocarcinome humain, et sur l'ensemble du génome chez la souris. De plus dans des modèles transgéniques murins, nous recherchons l'impact de différents gènes déjà connus pour leurs propriétés oncogéniques, anti-oncogéniques ou apoptotiques. Par ailleurs, des mutations fréquentes de la beta-catenine ont été récemment mises en évidence dans l'hépatoblastome chez l'homme et l'hépatocarcinome humain et murin. Pour mieux définir l'importance de l'activation oncogénique de la beta-caténine dans la transformation des cellules hépatiques, nous recherchons ses partenaires cellulaires et les gènes cibles activés dans le contexte du foie, ainsi que les conséquences pathologiques de l’activation de la beta-caténine sur la prolifération et la différenciation cellulaires, le pouvoir invasif de la tumeur et la survie des patients atteints de cancer du foie.

Recherche de gènes suppresseurs de tumeur impliqués dans le développement du cancer du foie (Anne DEJEAN)
L’inactivation somatique de gènes suppresseurs de tumeur (GST) est d’importance majeure dans le développement des cancers humains. Dans le but d’identifier des GST potentiellement inactivés au cours du développement du cancer du foie, une cartographie des pertes d’allèles les plus fréquentes a été réalisée sur l’ensemble des chromosomes humains dans plus de 120 hépatocarcinomes (HCC). Cet allélotypage nous a permis de mettre en évidence des pertes de matériel génétique fréquentes en 1p, 4q, 6q, 8p, 13q et 16p. Une région de 2cM en 8p23 fait déjà l’objet d’une étude approfondie. Un deuxième allélotypage restreint à l’analyse du chromosome 8 et réalisé sur 110 nouveaux cas d’HCCs a révélé l’existence de deux autres régions fréquemment délétées en 8p21/22 suggérant la présence de deux nouveaux GST dans ces régions. Afin d’identifier ces gènes nous avons étendu notre allélotypage secondaire à 200 nouveaux cas d’HCCs. Parallèlement, nous recherchons des délétions doubles et/ou hétérozygotes dans une centaine de lignées cellulaires tumorales (dont 60 d’origine hépato-biliaire). Des gènes candidats seront potentiellement identifiés dans les régions minimales de perte et des mutations ponctuelles somatiques seront recherchées dans ces gènes. Ces recherches, focalisées dans un premier temps sur le chromosome 8, seront par la suite étendues à d’autres régions chromosomiques, notamment la région 4q.

Bases moléculaires de la leucémie aiguë promyélocytaire (Anne DEJEAN)
Notre équipe étudie depuis plusieurs années le rôle des récepteurs aux rétinoïdes dans l'oncogénèse chez l'homme. Nous avons pu montrer que la translocation t(15,17) associée aux leucémies aiguës promyélocytaires (LAP) génère une protéine hybride entre la protéine PML et le récepteur alpha de l'acide rétinoïque (PML-RAR-alpha). La protéine PML est localisée au niveau de structures subnucléaires appelées corps nucléaires qui sont désorganisés de manière réversible par l'acide rétinoïque (AR) dans les cellules LAP. Cette observation, qui permet d'impliquer une structure nucléaire dans une pathologie humaine, corrèle de façon frappante avec l'effet thérapeutique de l'AR dans ce type d'hémopathie. Nous avons montré récemment que les protéines PML et SP100, les deux protéines des corps nucléaires connues à ce jour, sont modifiées de façon covalente par une petite protéine de 15 kd, SUMO-1. Cette modification, contrairement à l’ubiquitination, n’est pas associée à une dégradation protéique mais semble être responsable de l’adressage des protéines PML et SP100 vers les corps nucléaires. Nos travaux viseront d'une part à tenter d'élucider la fonction des structures nucléaires PML et notamment le rôle de cette nouvelle voie de modification post-traductionnelle SUMO-1 et d'autre part à clarifier le mécanisme d'action de l'hybride PML-RAR-alpha dans la genèse des LAP.

Antigène HBs et vaccination
(Marie-Louise MICHEL)
Pour aborder certains problèmes non résolus actuellement par la vaccination contre l'hépatite B, nous avons développé un modèle de vaccin génétique anti-hépatite B, basé sur l'injection intramusculaire de vecteurs plasmidiques codant pour les trois protéines d'enveloppe du virus. Ce nouveau type de vaccin permet d'obtenir, chez la souris, des réponses humorales et cellulaires multispécifiques, très stables. Chez des macaques Rhésus, des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de l'HBV et des anticorps anti-HBs ont été induits par injection de ces plasmides. Nous avons montré que ce type de vaccin pourrait également être utilisé pour rappeler une immunité ancienne due à des vaccins protéiques classiques. Les porteurs chroniques de l'HBV présentent un risque accru de développer un hépatocarcinome et représentent, par ailleurs, un réservoir important pour la dissémination du virus. Nous avons utilisé des souris transgéniques pour l'antigène de surface du virus (AgHBs) comme modèle d'étude et montré qu'il est possible chez ces souris d'induire par la vaccination génétique une réponse immunitaire suffisamment forte et efficace pour éliminer l'AgHBs sérique et contrôler l'expression des gènes viraux dans le foie. Ces résultats suggèrent que la vaccination à base d’ADN pourrait être une nouvelle approche thérapeutique pour les porteurs chroniques du virus. Nous participons également à un protocole multicentrique de vaccinothérapie des porteurs chroniques conduit par Christian Bréchot (Hôpital Necker). Chez ces patients, qui sont immunisés avec des vaccins recombinants classiques, nous avons caractérisé une réponse cellulaire de type Th1 induite par la vaccination et qui pourrait être responsable de l'élimination de l'ADN viral sérique observée chez certains patients après vaccination. L'AgHBs étant un immunogène particulièrement efficace, nous l'avons utilisé comme système de présentation d'épitopes B et T hétérologues. En collaboration avec Y. Rivière (I.P.) nous avons utilisé des vecteurs ADN codant pour des antigènes hybrides HIV1-HBs pour induire chez des macaques Rhésus une immunité humorale et cellulaire spécifique des virus HIV et HBV.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

DA Louise-Marie, IP

Chercheurs de l'unité

BUENDIA Marie-Annick, CNRS
DEJEAN Anne, INSERM
TRANSY Catherine, INSERM
WEI Yu, IP

Stagiaires de l'unité

DAVIET Laurent, Post-doc
FLAJOLET Marc, Post-doc
KIRSH Olivier, DEA
LEHEMBRE François, Thèse
LEVY Laurence, Thèse
LOIRAT Delphine, Thèse
MARSAC Delphine, thèse
MÜLLER Stefan, Post-doc
NEUVEUT Christine, Post-doc
PINEAU Pascal, Post-doc
SEELER Jacob, Post-doc
SITTERLIN Delphine, Thèse
WU Yuanfei, Thèse

Autre personnel de l'unité

BERGAMETTI Françoise, P7
MALANCHERE Evelyne, IP
MARCHIO Agnès, IP
MICHEL Marie-Louise, INSERM
PRIGENT Sylvie, INSERM
RENARD Claire-Angélique, IP

Publications de l'unité

98428542
98288809
98338004
98285783
98105811
98118456
99036419
98090450
99055551
98178654
98322752
99073513
98377416
98301571
99013027
98286136

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