Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Toxines et pathogénie bactérienne

CNRS URA 1858


Responsable : MOCK Michèle (mmock@pasteur.fr)

Résumé du rapport

La thématique porte sur l'étude des mécanismes de virulence d'une bactérie toxinogène à multiplication extracellulaire : Bacillus anthracis. Cette bactérie, pathogène pour l'homme et l'animal, est l'agent de la maladie du charbon. La virulence de B. anthracis nécessite simultanément la synthèse de toxines et la formation d'une capsule. Les spores de B. anthracis ont la capacité de germer dans les macrophages et l’expression des toxines débute dans ces cellules. La structure et le mode d'action cellulaire des toxines et leur rôle dans la pathogenèse sont étudiés. D'autre part, la surface de la bactérie, couche S et capsule, et son rôle dans l'interaction de ce pathogène avec l'hôte sont analysés. Enfin, B. anthracis peut être utilisé pour la production de protéines étrangères et comme vecteur vaccinal pour la présentation d'antigènes hétérologues in vivo.

Mots-clés: Anthrax / Couche S / Toxines / Virulence

Abstract

The virulence mechanisms of B. anthracis, the aetiological agent of anthrax, an extracellular, toxinogenic, bacterium, are investigated. Spores of B. anthracis germinate within the phagolysosome of macrophages and toxin expression begins at this step. The structural organisation, the cellular mode of action of toxins and their role in pathogenesis are analysed. The B. anthracis cell surface, the S-layer and capsule, and its role in the interaction of this pathogen with the host is under investigation. It was also shown that B. anthracis can be used to express foreign proteins and is therefore promising for the development of live veterinary vaccines.

Key-words: Anthrax / S-layer / Toxins / Virulence

Texte du rapport

Interaction de Bacillus anthracis avec l’hôte

(Chantal Guidi-Rontani)

Les mécanismes impliqués dans l’enclenchement de l’infection causée par l’inhalation de spores de B. anthracis ont été étudiés. Nous avons, à l’aide d’analyses en microscopie confocale par immunofluorescence, démontré la capacité des spores de B. anthracis à germer au sein de cellules phagocytaires telles que les macrophages alvéolaires et péritonéaux. Ce phénomène a pu être associé au phagolysosome de la cellule. De plus, des études en cytométrie en image ont montré que la synthèse des toxines commence au sein des macrophages et est donc étroitement couplée avec l’étape de germination. Par ailleurs, nous avons identifié sur le plasmide de virulence pXO1 de B. anthracis, un opéron de germination codant pour trois protéines. Cet opéron est nécessaire à une germination efficace de B. anthracis dans l’hôte et est impliqué dans la virulence de ce pathogène.

Toxines de Bacillus anthracis - Mode d'action

(Fabien Brossier - Michèle Mock)

Bacillus anthracis produit deux toxines composées de trois protéines : la toxine létale (PA + LF) est responsable de la mort de l’animal, et la toxine œdématogène (PA + EF), provoque la formation d’un œdème. PA joue un rôle-clé dans la pathogenèse, il est le composant commun qui permet de fixer et de délivrer EF et LF dans les cellules eucaryotes cibles. EF est une adénylcyclase calmoduline-dépendante et LF, une métalloprotéase. L’analyse de la structure cristallographique de PA définit quatre domaines fonctionnels. Des approches biochimiques et cellulaires ont montré que le domaine 1 permet de fixer LF ou EF et que le domaine 2 intervient dans leur translocation au sein des cellules eucaryotes cibles. Nous avons montré que le domaine 4 est impliqué dans la fixation de PA sur les cellules. De plus, la délétion d’une boucle de 19 acides aminés, située dans le domaine 4, diminue l’efficacité de fixation de PA sur son récepteur d’un facteur 10. Des souches de B. anthracis produisant la protéine PA mutée dans ses différents domaines fonctionnels ont été construites. L’étude de leurs propriétés in vivo indique une corrélation entre les étapes du mode d’action cellulaire des toxines et le processus infectieux.

Mise au point de vaccins multivalents

(Jean-Claude Sirard - Michèle Mock)

Une souche recombinante de B. anthracis produisant le composant Ib de la toxine iota de Clostridium perfringens protège l'animal contre une épreuve létale de toxine iota, par l'intermédiaire d'anticorps neutralisants. Une autre souche recombinante productrice de listériolysine acquiert une localisation intracellulaire et induit une protection envers une listériose expérimentale, via l'activation de lymphocytes CD8+ cytotoxiques spécifiques de la listériolysine. B. anthracis est donc un vecteur vaccinal en puissance permettant d'induire une réponse protectrice de nature humorale ou cellulaire.

La capsule

(Agnès Fouet)

Les bacilles isolés d'animaux malades du charbon sont capsulés. Nous avons construit et analysé des souches de B. anthracis recombinantes portant, au locus d'origine sur le plasmide pXO2, une fusion transcriptionnelle capB-lacZ. AtxA codé par l'autre plasmide de virulence, pXO1, augmente le niveau d'expression de capB, indépendamment des conditions de culture. Ainsi, il existe un régulon AtxA auquel appartiennent des gènes de pXO1 (toxines) et de pXO2 (capsule).

Les couches S

(Stéphane Mesnage - Agnès Fouet)

La capsule recouvre une couche structurée formant un réseau. Il est constitué principalement d’une protéine abondante, EA1. Une autre protéine abondante, Sap, peut constituer une couche S. Chacune possède, dans sa région N-terminale, une séquence répétée trois fois. Ce domaine permet l’ancrage des protéines de couche S et de protéines hétérologues, à un polysaccharide associé au peptidoglycane. Dans les mutants, capsule et couche S peuvent être synthétisées indépendamment.

Approche moléculaire de l’épidémiologie du charbon en France

(Guy Patra - Michèle Mock)

Le charbon est une zoonose atteignant tous les mammifères et plus particulièrement les herbivores. Cette maladie de répartition mondiale a considérablement régressé dans les pays occidentaux depuis la fin du siècle dernier. Néanmoins, le charbon existe toujours en France où il apparaît, chaque année, de façon sporadique dans diverses régions. Il existe très peu de données épidémiologiques, et rien au niveau moléculaire, sur le devenir des spores de Bacillus anthracis dans les terres contaminées. Des prélèvements animaux et environnementaux, provenant des foyers répertoriés ces dernières années, ont été étudiés. Une multiplexe PCR permet la caractérisation de B. anthracis par ses gènes de virulence plasmidiques et par une séquence chromosomique. Au cours de cette étude, nous avons isolé des Bacillus sp. du sol présentant des caractéristiques biochimiques proches de celles de B. anthracis et de B. thuringiensis (un germe pathogène de l’insecte) mais néanmoins identiques à aucun d’entre eux. Une analyse plus approfondie est en cours, afin de caractériser leur spéciation.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

LAMBRECHT Marie-Régine, IP

Chercheurs de l'unité

FOUET Agnès, CNRS
GUIDI-RONTANI Chantal, CNRS
MOCK Michèle, CNRS

Stagiaires de l'unité

BROSSIER Fabien, Doctorant
MESNAGE Stéphane, Doctorant
PATRA Guy, Post-doc
SIRARD Jean-Claude, Post-doc
RUFFIE Stépahnie, DEA

Autre personnel de l'unité

DUFLOT Edith, CNRS
LEVY Martine, IP

Publications de l'unité

98083055

98369614

98417444

98431546

98449882

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