Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Staphylocoques

I.P.


Responsable : EL SOLH Névine (nelsolh@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Les staphylocoques sont les agents étiologiques d'infections bactériennes sévères dont la prévalence est particulièrement élevée en pathologie infectieuse.Les difficultés thérapeutiques résultent de la multirésistance aux antibiotiques des souches hospitalières. L'identification et le typage moléculaire, comme l'étude de la résistance aux antibiotiques, sont des thèmes de recherche liés à l'activité du Centre National de Référence rattaché à l'Unité. La mise en évidence de facteurs pariétaux responsables de l'adhésion au polystyrène et aux protéines de la matrice extracellulaire est un axe de recherche visant à mieux comprendre la physio-pathologie des infections staphylococciques sur prothèse.

Abstract

Staphylococci cause severe bacterial infections. Staphylococcal infections are highly prevalent among infectious diseases. They can be difficult to treat because hospital strains are multiresistant to antibiotics. The research activities associated with the National Reference Center attached to the unit are identification and molecular typing of strains and analysis of resistance to antibiotics. Another research theme is the identification of cell wall factors responsible for adhesion to polystyrene and to proteins of the extracellular matrix. This work will help elucidate the physiopathology of staphylococcal infections of prostheses.

Texte du rapport

Etude comparative de plasmides véhiculant trois gènes de résistance aux streptogramines disséminés dans diverses espèces de staphylocoques (J. Allignet, N. El Solh)

Les analyses structurales de sept plasmides (26-45 kb) issus de trois espèces de staphylocoques (S. aureus, S. simulans, S. cohnii subsp. urealyticum) et le séquençage partiel de deux d'entre eux ont révélé l'existence d'un fragment d'ADN commun de 12,1 kb portant trois gènes de résistance aux streptogramines (vga, vat et vgb) et trois copies de la séquence d'insertion IS257. L'association des trois gènes de résistance a été attribuée à la cointégration de deux plasmides dont l'un porte le gène vga et un gène de réplication fonctionnel apparenté à ceux des plasmides de staphylocoques, pSX267 et pSK41, qui véhiculent de nombreuses copies de IS257. L'autre plasmide porte les gènes vga-vgb contigus ainsi que la région du plasmide de E. faecium, pAMß1, impliquée dans la réplication et incluant le gène de réplication repE interrompu par l'insertion de IS257.

Localisation subcellulaire de la protéine Vga responsable de la résistance à la streptogramine A (O. Chesneau, E. Dassa [UPMTG], P. Gounon [ME], N. El Solh)

La protéine Vga appartient à une classe particulière de systèmes ABC (ATP-binding cassette) apparemment dépourvus de domaines transmembranaires. La nature du mécanisme de résistance à la streptogramine A pourrait être dévoilée par l'utilisation d'anticorps dirigés contre Vga. Les premières étapes de ce travail ont abouti à l'obtention d'anticorps spécifiques de Vga dans le contexte génétique de l'espèce S. epidermidis. Des expériences de fractionnement cellulaire et de microscopie électronique sont en cours pour déterminer le tropisme de la protéine. Il y a peu d'arguments pour penser qu'elle interagit au niveau de la membrane avec un éventuel partenaire.

Recherche d'adhésines dans les souches de S. caprae responsables d 'infections sur prothèses ostéo-articulaires (J. Allignet, J. Galdbart, S. Aubert, A. Morvan, K. Dyke, P. Vaudaux, N. Desplaces, N. El Solh)

Les adhésines et le biofilm ont une contribution importante dans l'initiation des infections staphylococciques secondaires à l'implantation de biomatériaux. L'adhésion au polystyrène, au fibrinogène, à la fibronectine ou au collagène, ainsi que les gènes codant les adhésines staphylococciques déjà caractérisés, ont été recherchées pour 15 souches de S. caprae : 10 souches infectieuses et cinq souches isolées de lait de chèvres indemnes de mammite. Toutes les souches étudiées contiennent une protéine pariétale se liant à la fibronectine (175 kDa ou 97 kDa). La région N-terminale de la protéine de 175 kDa isolée de l'une des souches infectieuses présente des similitudes avec les autolysines staphylococciques. Ces résultats suggèrent la présence d'un gène codant une autolysine dotée d'un domaine de liaison à la fibronectine. Pour vérifier cette hypothèse, un fragment d'ADN qui hybride avec le gène codant l'autolysine de S. epidermidis, atlE, a été récemment isolé d'une souche de S. caprae, en vue de son séquençage.

Utilisation du plasmide pIP1713 comme outil de mutagénèse chez les bactéries à Gram-positif (O. Chesneau, R. Lailler, N. El Solh)

Le plasmide recombinant pIP1713 (11,9 kb), a été créé sur la base: (i) d'un vecteur navette, dérivé de pUC18 et de pE194ts, se répliquant de façon conditionnelle chez de nombreuses bactéries à Gram-positif, (ii) d'une séquence d'insertion IS1181, isolée précédemment au sein de l'Unité, (iii) d'un gène de résistance à l'érythromycine, ermC, qui est présent naturellement sur le vecteur, (iv) d'un gène de résistance à la tétracycline, tetT, qui a été greffée sur la séquence d'insertion. Il a été introduit chez Staphylococcus et Listeria par électroporation. Il a servi de réplicon donneur à la transposition de IS1181 en divers sites du chromosome bactérien. Deux mutants chromosomiques de S. carnosus ont été caractérisés: l'un est incapable d'utiliser le galactose comme source de carbone, l'autre ne produit pas de ß-galactosidase.

Typage génomique de souches nosocomiales de S. aureus résistantes aux ß-lactamines mais sensibles à la gentamicine. (J.-O. Galdbart, A. Morvan, N. El Solh)

Jusqu'en 1993, la majorité des souches de S. aureus résistantes aux ß-lactamines étaient également résistantes à la gentamicine (GmR). Les souches sensibles à la gentamicine (GmS) ont émergé en 1993 et leur incidence n'a pas cessé d'augmenter dans les hôpitaux français. Soixante-deux souches hospitalières GmS isolées dans neuf villes françaises ont été comparées à 15 souches GmR représentatives de celles disséminées dans les mêmes hôpitaux. Dix-huit génotypes majeurs ont été individualisés parmi ces souches : seulement deux d'entre eux incluaient des souches sensibles et résistantes à la gentamicine. Chacune des 15 souches GmR contenait six à 13 fragments de restriction SmaI hybridant avec la séquence d'insertion IS256 alors que seulement deux des 62 GmS véhiculaient de telles séquences. De ce fait, seules ces deux souches GmS ont été considérées comme étroitement apparentées à une souche GmR du même hôpital. La majorité des souches GmS ne dérive donc pas des souches GmR qui prédominaient auparavant. Cette étude a également révélé la dissémination de deux clones épidémiques dans diverses villes françaises.

Identification moléculaire des staphylocoques basée sur l'analyse des ribotypes et sur la recherche de fragments d'ADN spécifiques d'espèce (O. Chesneau, A. Morvan, S. Aubert, N. El Solh)

La base de données StaphDB rassemble 135 profils de restriction EcoRI et 120 profils de restriction HindIII qui correspondent aux ribotypes de 408 souches appartenant à 42 taxons du genre Staphylococcus. Son contenu est régulièrement mis à jour par l'analyse systématique des ribotypes d'au moins deux souches de chacun des taxons nouvellement décrits. Son utilisation contribue à diminuer l'incidence des souches inclassables (&fraq34; 1 à 2% des souches de notre recrutement annuel) et met en lumière d'éventuels problèmes de classification. Deux espèces, S. vitulus et S. pulvereri, décrites simultanément, ont été comparées sur le plan de leurs biotypes et sur le plan de leurs ribotypes. Un seul test biochimique, l'hydrolyse de l'esculine, est capable de discriminer les deux groupes de souches. Aucune différence n'est apparente au vue des ribotypes. Il convient donc d'évaluer les pourcentages d'homologie ADN-ADN pour définir au mieux le statut taxonomique de ces deux groupes bactériens.

Evaluation de différentes techniques de détection des bas niveaux de résistance à la vancomycine chez Staphylococcus aureus (O. Chesneau, A. Morvan, N. El Solh)

La détection des souches de S. aureus présentant une résistance hétérogène à la vancomycine pose d'évidents problèmes méthodologiques que l'antibiogramme standard ne peut résoudre. La fréquence de sélection des cellules résistantes (une sur 106 cellules de la population bactérienne) impose des inoculums s'écartant de ceux préconisés dans les conditions habituelles. Les critères d'interprétation des valeurs de CMI ( S &fraq34; 4mg/l; R „ 32 mg/l) méritent d'être modifiés, tout comme les modes de préparation des milieux gélosés (adoption de milieux riches). Un complet ré-étalonnage de toutes les méthodes habituellement utilisées au laboratoire a été effectué pour affiner la valeur prédictive des divers paramètres relatifs aux souches françaises.

Centre National de Référence des Staphylocoques

Identification et typage des souches, antibiogrammes, recherche de gènes de résistance aux antibiotiques et de gènes codant pour les toxines staphylococciques, préparation et fourniture de suspensions titrées de phages, entretien des collections de souches, expertises, formation de stagiaires.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

TRAN Catherine, IP

Chercheurs de l'unité

CHESNEAU Olivier, IP
EL SOLH Névine, IP

Stagiaires de l'unité

HAROCHE Julien, DEA
GALDBART Jacques, Thèse de Sciences

Autre personnel de l'unité

ALLIGNET Jeanine, IP
AUBERT Sylvie, IP
MORVAN Anne, IP

Publications de l'unité

van Belkum, A., W. van Leeuwen, M. E. Kaufmann, B. Cookson, F. Forey, J. Etienne, R. Goering, F. Tenover, C. Steward, F. O'Brien, W. Grubb, P. Tassios, N. Legakis, A. Morvan, N. El Solh, R. de Ryck, M. Struelens, S. Salmenlinna, J. Vuopio-Varkila, M. Kooistra, A. Talens, W. Witte and H. Verbrugh. 1998.Assessment of resolution and intercenter reproducibility of results of genotyping Staphylococcus aureus by pulsed-field gel electrophoresis of SmaI macroresctriction fragments : a multicenter study. J. Clin. Microbiol. 36:1653-1659.

El Solh, N., and J. Allignet.
1998. Staphylococcal resistance to streptogramins and related antibiotics. Drug Resistance Update 1:169-175.

Allignet, J., N. Liassine, and N. El Solh. 1998.Characterization of a staphylococcal plasmid related to pUB110, pIP1714, and carrying two novel genes, vatC and vgbB, encoding resistance to streptogramins A and B and similar antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 42:1794-1798.

Aubert, S., K. Dyke, and N. El Solh.
1998. Molecular analysis of two structurally related S. epidermidis plasmids conferring resistance to streptogramin A. Plasmid 40:238-242.

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