Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Station Centrale de Microcospie Électronique


Responsable : Gounon Pierre (pgounon@pasteur.fr)

Résumé du rapport

La Station Centrale de Microscopie Électronique est un laboratoire qui s'inscrit dans une logique à la fois de recherche et de service. Il dispose de moyens généraux techniques lui permettant d'aborder une large palette de méthodes de l'analyse ultrastructurale. Le laboratoire travaille en collaboration avec d'autres laboratoires de l'Institut Pasteur sur le thème général "Interactions cellules hôtes pathogènes". Toute une série de travaux ont porté sur les mécanismes d'entrée et de dissémination intracellulaire de deux bactéries Shigella flexneri et Listeria monocytogenes. Des travaux ont porté sur les mécanismes d'adhésion à la surface cellulaire de souches pathogènes d'Escherichia coli. Le laboratoire a étudié les interactions cellules-virus (VIH, cytomégalovirus humain, Ebola). La structure des parois bactériennes ont été analysées ainsi que les protéines exprimées à la surface des bactéries (chez E. coli, B. anthracis et L. monocytogenes). http://www.pasteur.fr/units/scme/index html

Abstract

The Central Electron Microscopy Facility is a laboratory sharing its time between basic research and service. On a collaborative basis, it operates a wide range of tools and methods to bring an ultrastructural analysis on cell-pathogens interactions. We have studied the entry mechanisms of Shigella flexneri, Listeria monocytogenes and pathogenic E. coli. Virulence factors of B. anthracis and interactions of human cytomegalovirus with various cells are currently under study. http://www.pasteur.fr/units/scme/index html

Texte du rapport

Interaction des souches de Escherichia coli exprimant le système d'adhésion AFA avec des cellules épithéliales (P. Gounon, M. Jouve) L'adhésion des bactéries aux muqueuses joue un rôle essentiel dans la colonisation des tissus de l'hôte. Le système d'adhésion AFA (pour Afimbrial Adhesin) est exprimé par des souches de Escherichia coli responsables d'infections urinaires et de diarrhées. Il est composé de deux adhésines, AfaE et AfaD. Nous avons montré qu'au cours de l'interaction bactérie-cellule HeLa (lignée de cellules épithéliales en culture), la protéine AfaE est responsable de l'adhésion tandis que la protéine AfaD est responsable de l'internalisation d'une sous population de bactéries adhérentes. De plus, nous avons montré récemment que l'adhésion des souches AFA par l'intermédiaire de l'adhésine AfaE provoque des dommages irréversibles entraînant la mort des cellules HeLa par nécrose. Cette observation suggère que l'adhésion des bactéries participe non seulement à l'implantation bactérienne et à la colonisation des tissus mais joue un rôle important dans les étapes ultérieures du processus infectieux. Nous avons de plus confirmé que la protéine AfaD est capable de provoquer l'internalisation des bactéries dans des cellules polarisées en culture mimant l'épithélium intestinal et l'urothélium qui sont les tissus cibles des souches AFA.

Etude structurale des facteurs de virulence de Bacillus anthracis (E. Tosi-Couture) Cette étude analyse les relations existant entre la structure moléculaire et la fonction des facteurs de virulence d'une bactérie toxinogène à multiplication extracellulaire, pathogène pour l'homme et l'animal et responsable de la maladie du charbon : Bacillus anthracis. La virulence de B. anthracis nécessite simultanément la synthèse de toxines et la formation d'une capsule protéique. Nous avons montré que la présence de la capsule était compatible avec la présence de couches S à la surface des bactéries. Les couches S sont des assemblages de protéines organisées en réseaux cristallins bidimensionnels à la surface de nombreuses bactéries. Chez B. anthracis, deux protéines, EA1 (Extractible Antigen 1) et Sap (Surface Array Protein), sont les constituants des couches S. Ces protéines (94 kDa) peuvent chacune indépendamment l'une de l'autre s'organiser en réseau. L'analyse cristallographique des images obtenues nous a permis d'établir une carte de projection du réseau des protéines EA1. Cette carte définit la symétrie et le maillage du cristal ainsi que la structure de la molécule. Nous étudions aussi les structures moléculaires qui composent la barrière physiologique externe de la spore de B. anthracis : l'exosporium. L'étude de l'ultrastructure complexe de l'exosporium permet d'approcher une meilleure compréhension de son rôle dans la pathogénicité de B. anthracis.

Entrée de Listeria monocytogenes dans les cellules (H. Ohayon) Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène capable d'entrer, de survivre et de se multiplier dans un grand nombre de types cellulaires aussi bien in vivo qu'in vitro. Nous avons montré que l'entrée dans les cellules épithéliales requiert l'expression de InlA une protéine bactérienne de surface, polarisée comme la protéine ActA, qui interagit avec la E-cadhérine des cellules mammaliennes et, notamment, avec les cellules Caco-2 en culture. Une seconde protéine InlB est requise pour l'entrée dans les hépatocytes en culture et dans d'autres lignées épithéliales ou fibroblastiques (Vero, Hep-2, HeLa). L'ensemble de l'étude a montré que InlB était suffisante pour l'entrée de L. monocytogenes dans les cellules hôtes ainsi que dans la transduction des signaux qui induisent la phagocytose de la bactérie.

Interactions CMVH - Cellules cibles - (A. Topilko) Dans le modèle de fibroblastes humains, le plus couramment utilisé pour les expérimentations in vitro, le cytomégalovirus humain pénètre dans la cellule par fusion avec la membrane plasmique. Dans d'autres modèles cellulaires (astrocytome, cellules de l'épithélium pigmentaire de la rétine, cellules endothéliales), le virus pénètre par un mécanisme d'endocytose. Nous avons pu montrer que ce mode d'entrée est plus lent et moins efficace, tant sur le plan du niveau de l'infection que sur le plan de la réplication virale.

Méthodologie :
Des recherches techniques sur l'inclusion dans les résines acryliques à basse température ou sur les méthodes de "freeze-drying" permettent de disposer maintenant de protocoles éprouvés et reproductibles.

Activités d'expertise :
Le laboratoire réalise des expertises industrielles, notamment dans le cadre des procédures de sécurité virale.

Enseignement :
La laboratoire accueille et encadre, chaque année, pour une formation initiale des stagiaires étrangers ainsi que les élèves du Cours de Microscopie Électronique de l'Institut Pasteur. Il participe aussi à d'autres cours de l'Institut Pasteur.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Danièle LHOUMEAU dlhoum@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

André TOPILKO, Chargé de recherche Institut Pasteur atopilko@pasteur.fr Éric LARQUET, Assistant Institut Pasteur elarquet@pasteur.fr

Stagiaires de l'unité

Mabel JOUVE, thésarde

Autre personnel de l'unité

Hélène OHAYON, Ingénieur Institut Pasteur eohayon@pasteur.fr Évelyne TOSI-COUTURE, Ingénieur Institut Pasteur ecouture@pasteur.fr Brigitte CHAVINIER-JOVÉ, Technicienne de laboratoire qualifiée Institut Pasteur Claude ROLIN, Aide-Photographe Institut Pasteur Christine VILEY, Agent de laboratoire Institut Pasteur

Publications de l'unité

(98278962) Arhets, P., Olivo, J.C. , Gounon, P. , Sansonetti, P. and Guillén, N. (1998). Virulence and functions of myosin II are inhibited by overexpression of light meromyosin in Entamoeba histolytica. Mol. Biol. Cell, 8, 1537-1547. (99000810) Berthet, F.X., M. Lagranderie, P. Gounon, C. Laurent-Winter, D. Ensergueix, P. Chavarot, F. Thouron, E. Maranghi, V. Pelicic, D. Portnoi, G. marchal, B. Gicquel. (1998). Attenuation of virulence by disruption of the Mycobacterium tuberculosis erp gene. Science, 282, 759-762. (98194719) Braun, L., H. Ohayon and P. Cossart. (1998). The InIB protein of Listeria monocytogenes is sufficient to promote entry into mammalian cells. Molecular Microbiology, 27, 1077-1087. (98416750) Gounon, P., J.P. Rolland. (1998). Modification of Unicryl composition for rapid polymerization at low temperature without alteration of immunocytochemical sensitivity. Micron, 29, 293-296. (98129094) Lemaire, M., I. Miras, P. Gounon and P. Béguin. (1998). Identification of a region responsible for binding to the cell wall within the S-layer protéin of Clostridium thermocellum. Microbiol., 144, 211-217. (98083055) Mesnage, S., E. Tosi-Couture, P. Gounon, M. Mock and A. Fouet. (1998). The capsule and S-Layer : two independent and yet compatible macromolecular structure in Bacillus anthracis. J. Bacteriol., 180, 52-58. (98148673) Pereg-Gerk, L., A. Paquelin, P. Gounon, I.R. Kennedy and C. Elmerich. (1998).A transcriptional regulator of the luxR-UhpA family, FlcA, controls flocculation and wheat root surface colonization by Azospirillum brasilense Sp7. Mol. Plant-Microbe Interact., 11, 177-187. (98008975)
(98194719)
(98053980)
(99121021)
(98012229)

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