Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Regulation Enzymatique et Activites Cellulaires

URA 1773


Responsable : VERON Michel (mveron@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L’activité du laboratoire est organisée autour de deux thèmatiques: (i) L'amibe Dictyostelium discoideum, système modèle pour l'étude du développement (rôle de la protéine kinase dépendante de l'AMP cyclique (PKA) et voie de signalisation NFkB ). (ii) La NDP Kinase, une protéine possédant à la fois une activité enzymatique de phosphorylation des nucléotides naturels et de leurs analogues utilisés en thérapie anti-HIV (AZT, D4T etc…), et des propriétés de fixation aux acides nucléiques et notamment à l'ADN simple brin.

Abstract

We have two main projects : (i) To use Dictyostelium discoideum as a model system to study development (role of cAMP dependent protein kinase (PKA) and of the NFkB signal transduction pathway). (ii) To study NDP kinase, a protein involved in tumor cells that carries both an enzymatic activity to phosphorylate natural nucleosides or analogs used in anti-HIV therapies (AZT, D4T etc..) and a single stranded DNA binding activity.

Texte du rapport

  1. LA DIFFERENCIATION CELLULAIRE CHEZ L'AMIBE DICTYOSTELIUM

Les amibes de Dictyostelium discoideum qui vivent normalement à l'état unicellulaire en se nourrissant de bactéries par phagocytose, s'engagent dans un cycle de différenciation quand elles sont privées d'apport nutritif. Après quelques heures de carence, elles migrent en réponse à des signaux d'AMP cyclique pour former un "agrégat" multicellulaire au sein duquel les cellules se différencient en pré-spores et pré-tige pour former un sporange composé d'une tige formée de cellules vacuolées supportant une masse de spores. Au cours des années passées, nous avons montré que la protéine kinase dépendante de l'AMPc (PKA) joue un rôle crucial à plusieurs étapes du développement de Dictyostelium.

Insertion au hasard de GFP dans la sous-unité R de la PKA de Dictyostelium Ricardo BIONDI (en collaboration avec le laboratoire de Christophe REYMOND à Lausanne)

Nous avons produit une collection de mutants de la sous-unité régulatrice de la PKA de Dictyostelium par insertion au hasard du gène de la GFP dans celui de la sous-unité R. Parmi les nombreux mutants obtenus, quelques uns conservent à la fois la fonction de fixation de l'AMPc et la capacité à inhiber l'activité de la sous-unité catalytique de la PKA, tout en ayant inséré la GFP sous forme repliée et fonctionelle. Nous cherchons maintenant à produire des insertions du même type dans la sous-unité catalytique en utilisant une GFP permettant le transfert de fluorescence (FRET) quand les sous-unités sont associées au sein de l'holoenzyme.

Présence de la voie de signalisation NF-kB chez Dictyostelium Eleonora PONTE et François TRAINCARD (en collaboration avec le laboratoire de Barrie COUKELL à Toronto)

Au moyen d'anticorps spécifiques des éléments murins de la voie de transcription NFkB (facteurs de transcription Rel/NFkB, inhibiteurs de type IkB et protéines kinases de type IKK), nous avons mis en évidence la présence des différents éléments de la voie de signalisation NFkB chez Dictyostelium. Ceci est confirmé par la présence, démontrée par EMSA, dans des extraits de Dictyostelium de protéines fixant des oligonucléotides portant des séquences consensus kB. De plus, les protéines homologues aux facteurs de transcripion NFkB sont transloquées du cytoplasme vers le noyau au cours du développement. Les gènes codant pour ces protéines sont en cours de clonage. Leur rôle potentiel dans la phagocytose, le développement et la mort cellulaire programmée des cellules de tige de Dictyostelium sera étudié au moyen des outils génétiques puissants dont nous disposons chez cet organisme

Sequençage du génôme de Dictyostelium
Carmen BUCHRIESER (en collaboration avec le Laboratoire de Génomique des Microorganismes Pathogènes de l'Institut Pasteur)

Le projet de séquençage complet du génome de Dictyostelium (36 Mb) vient de débuter. Il implique des équipes en Europe (en particulier dans le centre de grand séquençage de Jena en Allemagne) et aux USA (centre du Baylor College, Houston Tx). Nous participons à ce projet (séquence d'un fragment du chromosome 6) au sein d'un consortium financé par l'Union Européenne auquel participe principalement le Sanger Center (Cambridge, UK) et l'Université de Cologne (Allemagne).

B. LA NUCLÉOSIDE DIPHOSPHATE KINASE

La Nucléoside Diphosphate kinase (NDPK) échange un phosphate entre nucléoside triphosphates et nucléoside diphosphates. Le transfert du g-phosphate se fait par un mécanisme de type ping-pong qui comporte un intermédiaire enzymatique phosphorylé sur une histidine. Les NDPKs sont responsables de la synthèse des nucléosides triphosphates (NTP) et assurent ainsi l’équilibre du pool cellulaire de NTP. La structure tri-dimensionelle est connue à haute résolution. Les NDPKs d’origine eucaryote forment des hexamères (3 x 2) alors que celles d’origine procaryotes forment des tétramères.

Etude de la phosphorylation des analogues de nucléosides à propriétés anti-virales Benoit SCHNEIDER et Dominique DEVILLE-BONNE (en collaboration avec le laboratoire de Joël JANIN, à Gif-sur-Yvette)

La NDP kinase est un enzyme ubiquitaire présentant peu de spécificité pour les nucléotides substrats qui peuvent être des dérivés ribo- ou désoxyribo- de bases puriques et pyrimidiques. Aussi, son étude se place dans le contexte de l'élaboration de médicaments antiviraux et notamment anti-HIV (AZT, ddI, ddC, D4T , aciclovir, ganciclovir...). On sait en effet que les analogues de nucléosides ayant une action antivirale sont prescrits sous forme de nucléosides qui sont phosphorylés par des kinases cellulaires. La NDP kinase est responsable de la dernière étape de cette voie menant à la synthèse des analogues tri-phosphorylés qui sont des substrats de la transcriptase inverse empêchant l'élongation des chaines d'ADN viral. Nous étudions la cinétique de phosphorylation des dérivés diphosphates. De manière générale, les analogues de nucléosides modifiés en 3'OH du ribose ne sont pas très réactifs? Nous avons montré que lle D4T est un bien meilleur substrat pour la NDP kinase que l'AZT. La structure du complexe entre la NDP kinase et les analogues, déterminées à haute résolution, fournit une explication des propriétés biochimiques au niveau atomique. Par ailleurs, nous tentons de reconstituer in vitro la voie d’activation des analogues et cherchons à mettre en évidence d’autres kinases impliquées dans ce processus.

Etude de mutants inactifs
Benoit SCHNEIDER et Dominique DEVILLE-BONNE (en collaboration avec le laboratoire de Dan HERSCHLAG à Standford) Nous avons construit par mutagénèse dirigée plusieurs mutants inactifs de la NDP kinase où l’His catalytique est remplacée par une Gly (H122G) ou une Ala (H122A). Ces mutants ne catalysent plus l’échange de phosphate entre un NTP et un NDP. Ils facilitent cependant le transfert de phosphate entre l’ATP et un nucléophile exogène comme l’imidazole et présentent une très légère activité d’hydrolyse de l’ATP. L’étude de différents nucléophiles (imidazole, alcools, amines) a permis de mesurer l’importance du positionnement du nucléophile dans le site actif de l’enzyme dans la catalyse. L’addition d’une sonde fluorescente (Trp) à l’entrée du site actif du mutant H122G permet de mesurer, en l’absence de catalyse, l’affinité des nucléotides triphosphates naturels et des analogues antirétroviraux. Le D4T-TP, contrairement à l’AZT-TP, se lie à l’enzyme avec une très bonne affinité, probablement à l’origine de son excellent pouvoir antirétroviral.

Etude des interactions entre la NDP kinase et les acides nucléiques Sharona RAVEH et Fabrice AGOU
Chez l'Homme, les gènes nm23 qui codent pour les NDPK sont impliqués dans la différenciation, le développement, l’apoptose et la prolifération maligne. L'un des isozymes de la NDP Kinase humaine, la NDPK-B, a été identifiée comme un facteur transcriptionnel stimulant la transcription de l’oncogène c-myc. Nous cherchons à élucider le mécanisme moléculaire par lequel la NDPK-B stimule la transcription. En utilisant la NDPK-B recombinante purifiée, nous avons démontré que cette protéine interagit avec l'ADN simple brin et nous avons commencé à explorer les motifs structuraux et les formes oligomériques impliquées dans l’association spécifique de la NDPK-B à l’ADN. Cette propriété est absente chez la NDPK de Dictyostelium et chez l'isozyme NDPK-A, pourtant homologue à 88 % à la NDPK-B. Nous voulons maintenant rechercher l'existence d'association entre NDPK-B et d'autres protéines en relation avec leur propriété de stimulation de la transcription. Nous pensons que l’acquisition au cours de l’évolution de nouvelles fonctions liée à la capacité d'interaction avec l'ADN correspond à l’émergence de structure quaternaires distinctes formées à partir de sous-unités conservées.

Etude de la protéine CheY
Dominique DEVILLE-BONNE (en collaboration avec le Laboratoire de Jeff STOCK à Princeton)

La protéine CheY participe à la voie de transduction du signal chimiotactique chez les bactéries. Plusieurs protéines cellulaires sont impliquées, dont une protéine kinase phosphorylée sur une histidine (CheA) qui transfère son phosphate à la protéine " régulateur de réponse " CheY, elle-même phosphorylée sur un aspartate. Che Y peut aussi être phosphorylée par de petites molécules donneurs de phosphate comme l’acétylphosphate ou le phosphoramidate. Dans des expériences de mélange rapide, nous étudions la phosphorylation de CheY par ces petites molécules en tant que modèle du phosphotransfert.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Christiane Goisnard

Chercheurs de l'unité

        DEVILLE-BONNE Dominique Maître de Conférences,  Paris VI
        AGOU Fabrice    Assistant, Institut Pasteur

Stagiaires de l'unité

        BUCHRIESER Carmen       Stagiaire Post-Doctorale
        KREIMEYER Annett        Stagiaire Post-Doctorale
        PONTE Eleonora  Stagiaire Post-Doctorale
        RAVEH Sharona   Stagiaire Pré-Doctorale
        SCHNEIDER Benoit        Stagiaire Pré-Doctoral
        STOCK Jeff                              Professeur, Congé sabbatique (Princeton University)

Autre personnel de l'unité

        TRAINCARD François      Ingénieur Institut Pasteur
        CORTES Marie-Thérèse    Agent de Laboratoire

Publications de l'unité

LISTE DES PUBLICATIONS 1998

Traincard, F., Anjard, C., Van Bemmelen, M., Etchebehere, L., Dammann, H., Reymond, C. and Veron, M.(1998) The c-AMP dependent protein kinase from Dictyostelium. In " Proceedings of the Second European Symposium on Protein Phosphorylation in Plants " pp 57-61. Dammann, H., Traincard, F., Anjard, C., Van Bemmelen, M., Reymond, C. and Veron, M. (1998) Functional analysis of the catalytic subunit of Dictyostelium PKA in vivo, Mech. of Dev. 72 : 149-157 Mesnildrey, S., Agou, F., Karlsson, A., Deville-Bonne, D. and Veron, M. (1998) Coupling between catalysis and oligomeric structure in NDP kinase, J.Biol. Chem, 273 : 4436-4442. Schneider, B., Xu, Y., Sellam, O., Sarfati, R., Janin, J., Veron, M. and Deville-Bonne, D. (1998) Pre-steady state of reaction of Nucleoside Diphosphate Kinase with anti-HIV nucleotides. J. Biol. Chem. 273 : 11491-11497. Biondi, A. M., Baehler, P. J., Reymond, C. D. and Veron, M. (1998). Random insertion of GFP into the cAMP dependent protein kinase regulatory subunit from Dictyostelium discoideum. Nucleic Acid Research : 26 : 4946-4952 Schneider, B., Xu, Y. W., Janin, J., Veron, M. and Deville-Bonne, D. (1998). 3' phosphorylated nucleotides : tight binding inhibitors of NDP kinase activity. J. Biol. Chem : 273 : 28773-28778. Yamaoka, S., Courtois, G., Bessia, C., Whiteside, S. T., Weil, R., Agou, F., Kirk, H. E., Kay, A. J. and Israel, A. (1998). Complementation cloning of NEMO, a component of the IkB kinase complex essential for Nf-kB activation. Cell 93 :1231-1240. Deville-Bonne, D. Schneider, B., Bourdais, J. & Véron, M. (1998) Reaction of 2’,3’-dideoxynucleotides triphosphates with recombinant human nucleoside diphosphate kinase. in Purine & Pyrimidin Metabolism in Man, Griesmacher et al. Eds, Plenum Press, New York,vol IX, 569-573. Biondi, R.M., Schneider, B., Passeron, E. and Passeron, S. (1998) Role of Mg2+ in Nucleoside Diphosphate Kinase Autophosphorylation. Archives of Biochemistry and Biophysics, 353 : 85-92. Admiraal, S.J., Schneider, B., Meyer, P., Janin, J., Veron, M., Deville-Bonne, D. and Herschlag, D. (1999) Nucleophilic activation by positioning in phosphoryl transfer catalyzed by Nucleoside Diphosphate Kinase, Biochemistry , 38, 4701-4711. Agou, F., Raveh, S., Mesnildrey, S. and Veron, M. (1999) Single strand DNA specificity analysis of human NDP kinase B. J. Biol. Chem. (in press).

En cas de problèmes ou de remarques concernant ce serveur Web, écrire à info@pasteur.fr. Cette page a été modifiée pour la dernière fois le Mercredi 19 Mai 1999 à 14 h 12 (Temps Universel) .