Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Physiopathologie de l'infection


Responsable : MARCHAL Gilles (gmarchal@pasteur.fr)

Résumé du rapport

La réponse immunitaire joue un rôle déterminant dans l'établissement des lésions de la tuberculose. Des antigènes immunodominants de Mycobacterium tuberculosis ont été purifiés sur leur capacité à interagir avec des lymphocytes T ou des anticorps spécifiques induits par une immunisation par le BCG ou par une infection. L'immunogénécité de ces molécules dépend de leur glycosylation par des mannoses. Des immunisations génétiques (ADN nu) avec des plasmides codant l'une de ces molécules ont induit des réponses immunitaires dépendantes de lymphocytes T et une protection vis-à-vis d'infections expérimentales. M. tuberculosis pouvant persister sous forme quiescente durant plusieurs années, des modèles expérimentaux in vitro et in vivo ont été mis au point afin d'éprouver des gènes susceptibles d'intervenir dans cette persistance.

Abstract

The immune responses play a key role in the formation of tuberculosis lesions. Immunodominant antigens of Mycobacterium tuberculosis have been isolated and purified by their ability to interact with specific T lymphocytes or antibodies which have been induced by immunization with BCG or by infection. The immunogenicity of these molecules was related to their glycosylation by mannose residues. Genetic immunization (naked DNA) with plasmids containing genes coding for these molecules were able to induce T lymphocyte-dependent immune responses and a protection against a challenge with a virulent strain. M. tuberculosis can persist in lesions during many years. In vitro and in vivo experimental models were used to search for genes that might play a role in mycobacterial persistence.

Texte du rapport

  1. La déglycosylation des molécules Apa de M. tuberculosis diminue leur immunogénicité (Félix Romain, Cynthia Horn, Pascale Pescher, Pierre Chavarot, Gilles Marchal, en collaboration avec Abdelkader Namanne, Michel Rivière, Germain Puzo et Octavian Barzu)

Déglycosylation de protéines natives (Félix Romain) Un lot important de la protéine Apa, isolée sur sa capacité à être reconnue par les anticorps et les lymphocytes T de cobayes immunisés par des bactéries vivantes (BCG ou M. tuberculosis), a été purifié à partir de grands volumes de milieux de culture de BCG ou M. tuberculosis. L'analyse par spectrométrie de masse montre la présence de résidus glycosylés, hexoses, sur ces molécules. L'analyse chimique montre que ces hexoses sont des mannoses. Les molécules portant 5, 6 ou 7 mannoses sont les plus nombreuses (15 à 22%), les molécules portant 3, 4 ou 8 mannoses sont moins fréquentes (3 à 8%), les molécules portant 1, 2 ou pas de mannose sont rares (1 à 3%). Les molécules déglycosylées par voie chimique ou enzymatique perdent leur capacité à stimuler des lymphocytes T spécifiques provenant de cobayes immunisés par le BCG.

Purification de molécules Apa recombinantes (Cynthia Horn) Les molécules Apa produites par M. tuberculosis, M. bovis et BCG sont glycosylées de façon identique. Elles présentent aussi une capacité équivalente à stimuler les lymphocytes T de cobayes immunisés par le BCG. Ces molécules produites par des bactéries de M. smegmatis transformées par le gène codant Apa, sont également glycosylées par des résidus mannoses mais le type et l'importance de la glycosylation sont différents ; les molécules portant 7, 8 ou 9 mannoses sont très majoritaires. Ces molécules recombinantes sont moins actives in vivo et in vitro pour stimuler les lymphocytes T spécifiques que les molécules natives. Les molécules recombinantes, produites par E. coli transformé, ont une immunogénicité très réduite voire nulle. Elles ne sont, bien sûr, pas glycosylées. La glycosylation, mannosylation, de ces molécules apparaît indispensable pour stimuler les lymphocytes T spécifiques après l'immunisation par le BCG.

2. Vaccination génétique par des plasmides portant le gène codant Apa (Axel Garapin, Laurence Ma, Pascale Pescher, Anne-Marie Balazuc, Micheline Lagranderie, Gilles Marchal)

Des plasmides différant par le promoteur contrôlant l'expression du gène Apa ont été comparés. La présence de séquences immunostimulantes a également été étudiée. Ces immunisations génétiques (ADN nu) ont permis d'obtenir des réponses de type hypersensibilité de type retardé plus importantes que celles obtenues après des immunisations par les protéines natives dans divers adjuvants. Une protection vis-à-vis d'infections expérimentales a pu être induite. Grâce à cette technique d'immunisation la détection des molécules jouant un rôle dans la vaccination peut être abordée directement.

3. Utilisation des molécules Apa dans un test de diagnostic de la tuberculose (Serge Diagbouga, Gilles Marchal)

Des anticorps dirigés contre les protéines Apa existent dans le sérum d'une majorité de malades atteints de tuberculose. Afin de déterminer la valeur diagnostique d'un essai mettant en évidence ces anticorps, des sérums de sujets normaux, sensibilisés ou non à la tuberculine, ont été collectés ainsi que des sérums de malades atteints de différentes formes cliniques de tuberculose. En choisissant une spécificité élevée pour ce test (98%), la sensibilité de celui-ci est moyenne (43%). Cependant les résultats positifs paraissant indépendants de la forme clinique de la maladie, ce test pourrait être un apport pour établir un diagnostic parfois difficile. Une étude est en cours portant sur environ 1200 sérums de sujets normaux pour lesquels un interrogatoire et un examen clinique soigneux ont été effectués. Cette étude doit permettre de situer les limites de la spécificité de ce test lorsque la fréquence de la tuberculose est réduite.

4. Mécanismes de survie des mycobactéries (Olivier Dussurget, Gilles Marchal)

Résistance au stress oxydatif (Olivier Dussurget) Les mécanismes par lesquels les macrophages humains détruisent M. tuberculosis in vivo sont inconnus. Le rôle des dérivés actifs de l'oxygène dans cette destruction est incertain. Afin de tester l'hypothèse d'un rôle de ces dérivés actifs de l'oxygène dans le contrôle de la croissance des bacilles in vivo, nous étudions deux gènes, sodA et sodC, codant pour des superoxyde dismutases, ainsi que la régulation de leur expression chez M. tuberculosis. L'effet de l'inactivation de ces gènes est en cours de caractérisation en culture ainsi que dans des modèles animaux d'infection expérimentale.

Latence (Olivier Dussurget, Gilles Marchal) Lors d'une primo-infection par M. tuberculosis, la réponse immunitaire de l'hôte peut conduire certains bacilles à persister à l'état latent de nombreuses années avant d'être réactivés. Ils peuvent être à l'origine d'une tuberculose plusieurs années après la contamination initiale. L'hypothèse a été émise que l'adaptation métabolique de M. tuberculosis suite à la baisse progressive de la tension en oxygène en culture mime en partie l'induction de la phase de latence in vivo. Afin de tester cette hypothèse, nous étudions les protéines induites par la baisse de la tension en oxygène ainsi que l'effet de leur inactivation dans un modèle animal de latence puis de réactivation.

5. Comparaison de voies d'immunisation par le BCG (Anne-Marie Balazuc, Micheline Lagranderie, Mohammad Abolhassani, Gilles Marchal)

Le BCG a été administré par voie orale au tout début de son utilisation puis par voie intradermique, du fait d'une sensibilisation plus facile à induire par cette voie. Une vaccination par voie muqueuse permet cependant d'induire une immunité locale plus intense. Dans le but de mesurer la réponse immunitaire globale après immunisation locale, les voies de vaccination orale et intragastrique ont été comparées chez la souris à la voie intradermique. Les niveaux des réponses dans les différents organes lymphoïdes sont comparables. Les protections induites par ces diverses voies d'immunisation vis-à-vis d'une injection d'épreuve de M. tuberculosis sont également identiques. L'immunisation par voie intragastrique est donc efficace et n'entraîne pas de lésions vaccinales notables, au contraire de la voie orale qui crée des adénopathies cervicales importantes.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

COURMARCEL Fabienne, IP, fcourmar@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

GARAPIN Axel-Claude, IP

Stagiaires de l'unité

DIAGBOUGA Serge, thèse
DUSSURGET Olivier, post-doc
HORN Cynthia, thèse
LECOINTE François, scientifique du contingent

Autre personnel de l'unité

CHAVAROT Pierre, IP
MA Laurence, IP
MARANGHI Eddie, IP
PESCHER Pascale, IP
ROMAIN Félix, IP
WOLKOM Sylviane, IP

Publications de l'unité

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