Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Physiologie Microbienne

CNRS URA D1129


Responsable : TANDEAU de MARSAC Nicole (ntmarsac@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Apparues il y a environ 3,5 milliards d'années, les cyanobactéries représentent un groupe bactérien majeur tant par leur diversité morphologique et physiologique que par le rôle qu'elles ont joué en créant une atmosphère aérobie sur notre planète et jouent, encore de nos jours, dans l'équilibre des proportions entre le gaz carbonique et l'oxygène. En effet, ces organismes procaryotes partagent avec les plantes la capacité d'effectuer la photosynthèse en utilisant la lumière et l'eau pour la réduction du gaz carbonique, processus qui s'accompagne d'un dégagement d'oxygène. Possédant un très grand potentiel d'adaptation à des environnements, même extrêmes, elles colonisent la plupart des écosystèmes aquatiques et terrestres. Les travaux de recherche réalisés dans l'Unité sont organisés autour de deux axes principaux : 1. La PCC (Pasteur Culture Collection), centre de recherche et de documentation sur les cyanobactéries (http://www.pasteur.fr/Bio/PCC/); 2. Les mécanismes moléculaires de l'adaptation des cyanobactéries à l'environnement.

Abstract

Having appeared about 3.5 billion years ago, the cyanobacteria constitute a major bacterial group by the diversity of their morphological and physiological properties and by the role they played in the creation of an aerobic atmosphere and still play, nowadays, in the carbon dioxide and oxygen balance on our planet. These prokaryotic micro-organisms share with plants the capacity to perform oxygenic photosynthesis by using light and water for the reduction of carbon dioxide. Endowed with capacities of acclimation to a wide range of environmental conditions, including extreme ones, they colonize most aquatic and terrestrial ecosystems. Research work in the Unité de Physiologie Microbienne is focused on two main aspects: 1. The PCC ("Pasteur Culture Collection"), centre of research and documentation on cyanobacteria (http://www.pasteur.fr/Bio/PCC/); 2. The molecular mechanisms controlling the acclimation of cyanobacteria to their environment.

Texte du rapport

  1. La PCC, centre de recherche et de documentation sur les cyanobactéries.

La PCC ou Pasteur Culture Collection (R. Rippka). Avec plus de 700 souches pures, dont des cyanobactéries atypiques qui synthétisent de la chlorophylle b comme les plantes, la PCC est la plus importante collection de cyanobactéries dans le monde. Ce centre a des activités de conseil et d'identification ; il assure également l'entretien et la distribution des souches qui sont mises à la disposition des laboratoires de recherche et des industriels dans le monde entier. Une cinquantaine de nouvelles souches sont entrées dans la collection après purification, dont des Microcystis sp. potentiellement toxiques, qui proviennent de diverses régions du monde, et des Synechococcus sp. du Lac de Constance (Allemagne), qui sont particulièrement riches en phycoérythrine.

Biodiversité et potentialités biotechnologiques de la PCC (projet BASIC "Biodiversity: Applied and Systematic Investigations of Cyanobacteria", programme européen "Biotechnology", 1996-99) (M. Herdman et R. Rippka). Les objectifs du réseau européen BASIC qui comprend treize équipes sont de : i) réviser la taxonomie des cyanobactéries, en combinant des approches physiologique, biochimique et de biologie moléculaire ; ii) identifier des composés bioactifs et/ou d'intérêt biotechnologique et étudier leur distribution chez les cyanobactéries ; iii) identifier les espèces en culture pure ou dans leur milieu naturel en utilisant des sondes spécifiques des gènes codant les ARN ribosomaux 16S et des ITS ("Intergenic Transcribed Spacer") situés entre les gènes des ARN ribosomaux 16S et 23S. Notre Unité fournit les souches axéniques et éventuellement de la biomasse à chaque équipe du consortium, constitue une documentation photographique portant sur la morphologie et détermine les propriétés physiologiques et génétiques, ainsi que les relations phylogénétiques des cyanobactéries de la PCC.

Bases de données des cyanobactéries de la PCC (M. Herdman). 1. La base de données des propriétés des cyanobactéries de la PCC est en évolution continue. Deux versions sont disponibles comme remplacement ou complément du catalogue : une version complète (logiciel Microsoft Access sous Windows 95) et une version "runtime" (logiciel de lecture Microsoft). Cette base de données est également accessible sur le Web, via le serveur de l'Institut Pasteur (http://www.pasteur.fr/Bio/PCC/). 2. La base de données des ARN ribosomaux 16S, représentative de la biodiversité des cyanobactéries, contient maintenant 305 séquences. 3. Une base de données des séquences ITS a été créée, dans le but d'établir un moyen rapide d'identification des souches.

Détermination de la capacité de dégradation des polychlorobiphényles par les cyanobactéries de la PCC (N. Tandeau de Marsac). Les polychlorobiphényles (PCB) sont des molécules aromatiques à différents niveaux de chloration, très stables d'un point de vue chimique et thermique. Très utilisés dans la construction des transformateurs électriques durant près de 20 ans, les PCB ont progressivement pollués l'environnement. Le projet R & D, entre l'Institut Pasteur, Schneider-Electric et l'E.D.F. vise à déterminer les capacités de biodégradation des cyanobactéries de la PCC. Le protocole expérimental a été optimisé pour les cyanobactéries et validé en utilisant des souches bactériennes de référence. Une trentaine de souches de la PCC ont été testées, mais aucune ne dégrade les PCB de manière significative. D'autres cyanobactéries, dont des souches isolées de sites pollués, sont en cours d'analyse. La construction de cyanobactéries recombinantes exprimant les gènes bph impliqués dans le métabolisme des PCB chez des bactéries aérobies est en cours, afin de déterminer si elles peuvent être utilisées plus efficacement que les bactéries desquelles les gènes bph sont issus.

2. Les mécanismes moléculaires de l'adaptation des cyanobactéries à l'environnement.

Les cyanochromes, photorécepteurs analogues aux phytochromes des plantes (N. Tandeau de Marsac). Par des analyses phylogénétiques, nous avons montré que les cyanochromes (photorécepteurs de cyanobactéries) sont les ancêtres des phytochromes des plantes, photorécepteurs impliqués dans de multiples processus biologiques, tels que la germination, la floraison, la pigmentation etc. Un opéron cphA1-rcpA1 et deux unités monocistroniques, cphA2 et rcpA2, ont été caractérisés chez Calothrix PCC 7601. L'opéron cphA1-rcpA1 code une histidine kinase régulée par la lumière (le cyanochrome CphA1) et un régulateur (RcpA1), qui sont homologues aux couples transmetteur/receveur des systèmes à deux composants bactériens. Ces protéines, par un mécanisme de phosphorylation/déphosphorylation, interviennent dans une étape précoce de la transmission du signal lumineux rouge clair/rouge sombre. Les protéines CphA2 et RcpA2 sont homologues à CphA1 et RcpA1, respectivement. Cependant, alors que CphA1 possède le résidu cystéinyl requis pour la fixation à l'apoprotéine d'un chromophore de type biline, CphA2 possède un résidu leucyl à cette position (collaborations avec W. Gärtner, T. Hübschmann et T. Börner, Allemagne). Des études pour la cristallisation de CphA1 sont en cours dans le groupe de P. Jordan (G.B.).

Éléments de régulation impliqués dans la synthèse/dégradation des phycobiliprotéines et dans la différenciation cellulaire (J. Houmard et N. Tandeau de Marsac). Chez Calothrix PCC 7601, l'adaptation chromatique complémentaire fait intervenir des régulations à la fois transcriptionnelles et post-transcriptionnelles de la synthèse des protéines qui constituent les antennes photocollectrices (phycocyanine-2, PC2, synthétisée sous lumière rouge, et phycoérythrine, PE, sous lumière verte). Les régulations transcriptionnelles impliquent au moins trois protéines affines de l'ADN, RcaA, RcaB et RcaD. La spécificité de RcaA et de RcaD pour les promoteurs des gènes codant PE et PC2, respectivement, dépend de leur état de phosphorylation. Le gène rcaA spécifie une glutamyl-ARNt synthétase, enzyme connue pour son rôle dans la traduction des protéines et la biosynthèse des chromophores. Des expériences génétiques sont en cours pour déterminer son rôle dans la régulation de la synthèse de PE. Le gène correspondant à la protéine RcaD a été identifié, son produit a effectivement les caractéristiques d'une protéine affine de l'ADN, mais ne possède pas d'équivalent dans les banques de données actuelles. Deux autres gènes nblA et tspO, vraisemblablement impliqués dans le contrôle de la synthèse et de la dégradation des phycobiliprotéines ont été identifiés.

L'AMP cyclique, messager secondaire synthétisé par l'adénylcyclase, s'accumule pendant la première heure de la différenciation des filaments végétatifs en hormogonies chez Calothrix PCC 7601. Le gène cyaC spécifie une adénylcyclase de classe III, dite universelle. Cette enzyme de 120 kDa a une organisation modulaire avec deux domaines de type régulateur, qui sont homologues à ceux des systèmes à deux composants bactériens, un domaine histidine kinase, un domaine détecteur de signal et le domaine catalytique de l'enzyme proprement dit. Des études sont en cours pour déterminer les conditions d'expression du gène cyaC et élucider le processus de transmission du ou des signaux à l'intérieur de la protéine correspondante.

PII, un transmetteur de signal qui coordonne les métabolismes de l'azote et du carbone (N. Tandeau de Marsac). La protéine PII (GlnB) de Synechococcus PCC 7942 diffère de celle des entérobactéries par son type de modification post-traductionnelle (phosphorylation et non uridylylation) et par les conditions qui conduisent à sa modification, le 2-oxoglutarate jouant un rôle majeur dans ce processus. En présence d'ammoniaque, PII sous sa forme non phosphorylée bloque l'entrée des ions nitrate/nitrite, fonction nouvelle pour cette protéine dans le monde bactérien. En l'absence d'ammoniaque, à la fois la phosphorylation et un autre effecteur sont requis pour rétablir l'entrée de ces ions. Cet effecteur est vraisemblablement le 2-oxoglutarate dont il a été montré qu'il se lie à PII in vitro (collaboration avec E. Flores et A. Herrero, Espagne, et avec K. Forchhammer, Allemagne). L'expression du gène glnB et la phosphorylation de son produit sont partiellement contrôlées par NtcA, effecteur transcriptionnel pléiotrope impliqué dans la régulation de l'assimilation de l'azote chez les cyanobactéries. PII intervient également dans le contrôle du transport du bicarbonate et dans l'activité photosynthétique chez Synechocystis PCC 6803 (collaboration avec S. Bédu et R. Jeanjean, LCB, Marseille).

Les vésicules à gaz, flotteurs intracellulaires responsables de la formation des efflorescences, souvent cause de nuisances dans l'environnement (N. Tandeau de Marsac). Plusieurs gènes impliqués dans la synthèse des vésicules à gaz (GV), gvpA, orf1, gvpN, gvpJ et gvpK, ont été caractérisés chez Pseudanabaena PCC 6901. Les quatre premiers gènes forment un opéron dont la transcription est segmentée. GvpA, et peut être GvpJ, sont des protéines de structure, GvpN pourrait avoir un rôle dans la régulation de la synthèse des GV. Le rôle de GvpK est inconnu. orf1, gène présent uniquement chez quelques cyanobactéries appartenant au genre Pseudanabaena, code une protéine plus homologue à la protéine GvpC d'archéobactéries qu'à celle de cyanobactéries. Chez la cyanobactérie Anabaena flos-aquae, GvpC renforce la structure des GV, mais chez les archéobactéries, comme chez Pseudanabaena spp., son rôle reste à préciser.

Prochlorococcus marinus, une cyanobactérie atypique (Projet européen PROMOLEC "Prochlorococcus molecular ecology", programme MAAST III, 1998-2001) (R. Rippka et N. Tandeau de Marsac). Cette cyanobactérie, de très petite taille (diamètre 0.5-0.6 mm), a le plus petit génome (2Mb) et le plus faible pourcentage G+C (32%). Ses antennes photosynthétiques sont constituées de complexes protéiques contenant des divinyl-chlorophylles a et b. Elle prolifère en abondance jusqu'à 200 m de profondeur dans les océans oligotrophiques, tropicaux et subtropicaux. De nombreux essais ont été faits pour tenter d'obtenir la croissance de cette souche sur milieu solide, ils devront être continués. Certains aspects du métabolisme de l'azote sont à l'étude. Cette souche ne croit pas en présence de nitrate mais seulement en présence d'ammoniaque ou d'urée grâce à une activité uréase, qui est constitutive. L'uréase a été purifiée à homogénéité pour sa caractérisation biochimique et pour l'identification des gènes correspondant aux différentes sous-unités (collaboration avec T. Jahns, Allemagne).

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

LEFEBVRE Jacqueline, IP

Chercheurs de l'unité

HERDMAN Michael, CNRS
HOUMARD Jean, CNRS
RIPPKA-HERDMAN Rosmarie, IP

Stagiaires de l'unité

ALBOUY Delphine, Post-doc
GOMEZ OCHOA de ALDA Jesus, Post-doc
ITEMAN Isabelle, Post-doc
LEE Hyun-mi, Thèse
LUQUE Ignacio, Post-doc
MHIRI Corinne, Post-doc
NOUBIR Sanaâ, Thèse
PALINSKA Katarzina, Post-doc

Autre personnel de l'unité

CASTETS Anne-Marie, CNRS
COURSIN Thérèse, IP
LAURENT Thierry, IP

Publications de l'unité

98187245
Schyns G., Jia L., Coursin T., Tandeau de Marsac N. and J. Houmard. (1998). Promoter recognition by a cyanobacterial RNA polymerase: in vitro studies with the Calothrix sp. PCC 7601 transcriptional factors RcaA and RcaD. Plant Mol. Biol. 36:649-659.

98268347
Lee H.-M., Flores E., Herrero A., Houmard J. and N. Tandeau de Marsac. (1998). A role for the signal transduction protein PII in the control of nitrate/nitrite uptake in a cyanobacterium. FEBS Lett. 427:291-295.

98304077
Hanson T.E., Forchhammer K., Tandeau de Marsac N. and J.C. Meeks. (1998). Characterization of the glnB gene product of Nostoc punctiforme strain ATCC 29133: The PII protein may be essential. Microbiology 144:1537-1547.

Tandeau de Marsac N. and J. Houmard. (1998). Acclimation of the filamentous cyanobacteria Calothrix spp. to the environment: Physiological and molecular studies. In: Cyanobacterial Biotechnology. G. Subramanian, B.D. Kaushik and G.S. Venkataraman (Eds). Science Publishers Inc., Enfield, U.S.A. pp. 315-328.

99018200
Garcia-Fernández J.M., Hess W.R., Houmard J. and F. Partensky. (1998). Expression of the psbA gene in the marine oxyphotobacteria Prochlorococcus spp. Arch. Biochem. Biophys. 359:17-23.

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