Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Pharmacologie Cellulaire

INSERM U 485


Responsable : Pr B. Boris VARGAFTIG (vargafti@pasteur.fr)

Résumé du rapport

En poursuivant l'étude du rôle de l'éosinophile dans l'allergie respiratoire, nous avons montré la présence de précurseurs d'éosinophiles dans les voies aériennes des souris hyper IgE immunisées, leur déplétion supprimant l'expression de cette allergie. Par ailleurs, pour mieux comprendre les mécanismes d'activation du mastocyte, cellule cible essentielle dans l'allergie, nous avons généré des anticorps monoclonaux qui reconnaissent des effecteurs moléculaires impliqués dans cette activation et sommes en train d'identifier ces derniers par clonage d'expression. L'administration d'endotoxine bactérienne à la souris induit une hyperréactivité bronchopulmonaire dont le mécanisme diffère de celui qui prévaut dans l'allergie, accompagnée d’une intense migration de neutrophiles, dont le rôle est à l'étude. Dans le cadre de la modélisation du Syndrome de Détresse Respiratoire Aiguë (SDRA), nous avons montré que le recrutement des neutrophiles dans les voies aériennes est en partie responsable de l'augmentation de la perméabilité vasculaire. In vitro, les neutrophiles sont ainsi capables d'interagir avec les cellules environnantes, en particulier avec les monocytes. Cette migration des neutrophiles résulterait, entre autre, de l'absence de formation d'IL-10 protectrice par les macrophages alvéolaires activés. Chez le cobaye, ces macrophages produisent une phospholipase A2 sécrétée (sPLA2) suite à une stimulation par le LPS. Libérée dans l'espace alvéolaire, cette PLA2 est impliquée dans l'hydrolyse des phosholipides du surfactant pulmonaire, qui conduit au collapsus alvéolaire. La synthèse de la sPLA2 est réprimée par la PGE2 par un rétrocontrôle négatif impliquant l'AMPc, alors que son activité est inhibée par une protéine du surfactant, la SP-A. Ces deux mécanismes de régulation joueraient un rôle essentiel dans le contrôle de l'hydrolyse des phospholipides du surfactant au cours du SDRA. Par ailleurs, nous avons montré, dans des cellules endothéliales pulmonaires humaines, que l'expression de la cyclooxygénase-2, qui est augmentée par des cytokines pro-inflammatoires, est négativement modulée par l'AMPc extracellulaire via une ecto-protéine kinase A. Globalement, les recherches en cours permettent de corréler les mécanismes de l’inflammation allergique et non allergique des voies aériennes, et conduisent à un modèle intégré qui est en cours de validation pour l’environnement.

Abstract

In continuation to our investigations on the role of eosinophils in inflammation, we demonstrated the presence of their precursors in the airways of immunized hyper IgE mice, and that their depletion suppresses the expression of this allergy. In addition, to better understand the mechanisms of mast cell activation, an important target in allergy, we generated monoclonal antibodies which recognize molecular effectors implicated in this activation, and we are now identifying the latter by expression cloning. The administration of bacterial endotoxin lipopolysaccharide (LPS) to mice also induces bronchopulmonary hyperresponsiveness accompanied by intense neutrophil sequestration into the airways. This may provide a model of Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS), in which neutrophil migration to the airways accounts for an increased vascular permeability. Neutrophils interact with other cells, particularly with monocytes. Their migration into the airways would involve, among other factors, the failure of the activated alveolar macrophages to produce the counter-regulator IL-10. In the guinea-pig, these macrophages secrete phospholipase A2 (sPLA2) upon stimulation with LPS. Once released into the alveolar space, sPLA2 hydrolyses the surfactant phosholipids, leading to alveolar collapse. Synthesis of sPLA2 is downregulated by PGE2 via a negative feedback involving cyclic AMP, whereas its activity is inhibited by the surfactant protein SP-A. Both mechanisms of regulation may be essential for the control of the hydrolysis of surfactant phospholipids during ARDS. We also demonstrated that the expression of cyclooxygenase-2 in human endothelial cells, which is augmented by proinflammatory cytokines, is downregulated by extracellular cyclic AMP via an ecto-protein kinase A. Overall, the investigations in progress allow to correlate the mechanisms of allergic and nonallergic airways inflammation and functional disturbances and lead to an integrated model which is being validated for environmental situations.

Texte du rapport

Mécanismes de l'hyperréactivité bronchique allergique et non-allergique (B. Boris Vargaftig)

L'hyperréactivité bronchopulmonaire, une capacité accrue des voies aériennes à répondre à des stimuli non-spécifiques, constitue un marqueur clinique et expérimental des maladies pulmonaires allergiques et non-allergiques. Elle se manifeste après une seule provocation antigénique chez les souris dites BP2, caractérisées par des titres considérables d'IgE circulante. Cette hyperréactivité corrèle avec une intense éosinophilie des voies aériennes et avec leur invasion par des lymphocytes T, probablement de phénotype Th2. L'hyperréactivité est suivie par une intense métaplasie mucosale, qui devrait concerner le gène MUC5ac.

Par ailleurs, l'administration de LPS par voie aérienne à la souris C57BL/6 est suivie par le recrutement de neutrophiles dans les poumons et les voies aériennes, par des titres pulmonaires accrus en TNF-a, par une augmentation des résistances des voies aériennes et par une hyperréactivité bronchopulmonaire. Cette dernière ne dépend pas directement du recrutement des neutrophiles, même si leur élimination la supprime. Nous avons montré que l'administration simultanée ou séquentielle de doses sous-efficaces d'allergène (ovalbumine) et de LPS aux souris BP2 est suivie d'effets très marqués, notamment par une intense hyperréactivité bronchopulmonaire et par une formation extrêmement augmentée de TNF-a dans les voies aériennes. Cette démonstration sera valorisée dans le cadre des études concernant les interactions environnementales qui débutent dans l'Unité.

Interaction des neutrophiles avec les cellules de l'environnement vasculaire et aérien (Michel Chignard)

Les neutrophiles sont des participants actifs dans différentes pathologies pulmonaires inflammatoires (emphysème, bronchite chronique, syndrome de détresse respiratoire aiguë,...) ou infectieuses (mucoviscidose, aspergillose invasive,…). Leurs effets s'exercent en particulier au travers de la libération de trois sérine-protéinases : la cathepsine G, l'élastase et la protéinase 3. Si elles sont connues depuis longtemps pour leurs activités protéolytiques sur des protéines de la matrice extracellulaire, des effets sur les cellules sont de plus en plus décrits et pourraient leur conférer un rôle nouveau dans les processus inflammatoires. Ainsi, nous avons montré que la cathepsine G est capable d'activer les plaquettes. Quant à l'élastase, elle augmente la réponse plaquettaire et ceci au travers d'une activation de l'intégrine alphaIIbbeta3, un récepteur membranaire liant le fibrinogène. Cette activation est la conséquence d'une protéolyse de la chaîne lourde de la sous-unité alphaIIb, ayant pour conséquence un changement de conformation de l'ensemble de l'intégrine. La cathepsine G et l'élastase agissent également sur les cellules endothéliales en inhibant spécifiquement leur activation par la thrombine. Le mécanisme sous-jacent est une protéolyse du récepteur de la thrombine. A l'aide de peptides synthétiques analysés par spectrométrie de masse, nous avons pu mettre en évidence plusieurs sites de clivage au sein de ce récepteur. La cathepsine G et l'élastase modifient également la réponse des monocytes aux lipopolysaccharides bactériens (LPS), sous forme d'une inhibition de la synthèse du TNF-alpha. En fait, les protéinases, libérées par exocytose des neutrophiles activés, provoquent la disparition de l'expression d'un récepteur membranaire spécifique du LPS, le CD14. Cet effet est la conséquence d'une hydrolyse enzymatique de ce récepteur. Des travaux sont actuellement entrepris afin d'évaluer les effets de ces mêmes protéinases sur les cellules épithéliales pulmonaires, concernant en particulier leur capacité d'adhésion intercellulaire et d'adhérence à la matrice extracellulaire. In vivo, les neutrophiles envahissent les différents compartiments pulmonaires lors d'une infection locale ou systémique. Dans un modèle expérimental chez la souris, nous avons montré que l'administration de LPS induisait la migration des neutrophiles et la libération d'élastase dans les espaces aériens. Cet afflux est contrôlé, en partie, par le TNF-alpha produit par les macrophages alvéolaires. Par contre, la synthèse de l'IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, est, de façon inattendue, totalement absente. Toutefois, lors d'une infection par A. fumigatus, l'IL-10 peut, dans certaines conditions, être détectée. Cette différence pourrait résider dans le recrutement, lors de d'une inflammation prolongée, de nouvelles cellules tels que les monocytes capables de produire l'IL-10.

Rôle de la phospholipase A2 dans l’inflammation pulmonaire (Lhousseine Touqui)

L'administration d'une endotoxine bactérienne, le lipopolysaccharide (LPS), par voie intra-trachéale provoque une inflammation pulmonaire aiguë chez le cobaye qui reproduit les critères anatomo-pathologiques du syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) chez l'homme. L’inflammation pulmonaire observée chez le cobaye est accompagnée d'une expression accrue de la sPLA2 et de sa libération dans l'espace alvéolaire et dont les macrophages sont la principale source. Des résultats récents montrent que la synthèse de cette enzyme est également induite dans un modèle de SDRA consécutif à une administration intra-trachéale de Pseudomona aeruginiosas chez le rat. Chez le cobaye, cette expression est induite par un processus autocrine/paracrine impliquant le TNF-alpha et inhibée par la prostaglandine E2 (PGE2). Néanmoins, les cellules sources et les mécanismes impliqués dans la régulation de l’expression de la sPLA2 chez le rat restent encore à élucider. Nous avons enfin montré que la sPLA2 est impliquée dans la " destruction " du surfactant pulmonaire aussi bien le cobaye traité par le LPS que chez le rat infecté par Pseudomona aeruginiosas. L’altération du surfactant conduit à l'apposition permanente des parois alvéolaires entravant ainsi la diffusion de l'oxygène, ce qui peut contribuer à la survenue de la détresse respiratoire. Cette altération est due, au moins en partie, à l'hydrolyse par la sPLA2 des phospholipides du surfactant qui génèrent, en outre, des lyso-phospholipides hautement cytotoxiques pour les cellules endothéliales et épithéliales. Cette hydrolyse est régulée par une protéine du surfactant, la SP-A (surfactant protein A) qui inhibe l’activité de la sPLA2 par une interaction spécifique et calcium-dépendante. Ainsi, l’inhibition de la synthèse et/ou de l’activité de la sPLA2 constitue un axe majeur de recherche pour notre équipe qui vise à mettre au point une thérapie prometteuse pour le SDRA chez l’homme, une pathologie pour la quelle aucun traitement efficace n’existe encore.

Etude des voies de signalisation au sein des plaquettes et des cellules endothéliales pulmonaires humaines (Mohamed Hatmi)

Les cellules endothéliales interagissent avec les autres cellules du pool vasculaire, en particulier les plaquettes. Cette interaction met en jeu plusieurs types d’enzymes dont les plus importantes sont les phospholipases, les prostaglandines H synthétases et les protéines kinases. Dans la première partie de notre travail, nous avons démontré que la phospholipase A2 soluble de type II (sPLA2) libérée par les plaquettes activées, n’est pas captée à partir du plasma mais qu’elle est bien d’origine mégacaryocytaire. Plusieurs arguments ont pu être, en effet, apportés: i) les plaquettes expriment non seulement la protéine de la sPLA2 mais aussi son ARNm, ii) les plaquettes sont incapables de capter la sPLA2 recombinante à partir du milieu extracellulaire et enfin, iii) l’expression de cette enzyme a été objectivée aussi dans les mégacaryocytes, précurseurs des plaquettes. Nous avons examiné, ensuite, le rôle de la sPLA2 dans l’hydrolyse des phospholipides membranaires. Nous avons conclu, tout particulièrement que la sPLA2 ne participe pas à la libération de l’acide arachidonique au cours de l’activation plaquettaire. Ce rôle est essentiellement assuré par la phospholipase A2 cytosolique. Enfin, nous avons montré que l’activité de la sPLA2 est inhibée de façon réversible par la protamine et par des peptides riches en acides aminés basiques tels que la poly-L-lysine et la poly-L-arginine. Outre leur capacité à inhiber l’activité de la sPLA2, ces substances affectent aussi sa libération à partir des granules a plaquettaires. La deuxième partie de notre activité concerne l’étude du rôle modulateur de l’AMPc, nucléotide cyclique généré à partir de l’ATP sous l’action de l’adénylyl cyclase. Ce nucléotide joue un rôle important dans la régulation de la fonction plaquettaire. Son élévation intracytosolique active la protéine kinase (PK) A et s’oppose à la mobilisation du calcium ionique. Bien que largement documenté sur le versant intra-cellulaire, son rôle extra-cellulaire est encore inconnu. Nous avons démontré, à la surface des plaquettes humaines au repos, l’existence d’une activité PK dépendante de l’AMPc extracellulaire et qui est fortement affectée par le PKI, un inhibiteur spécifique de la PKA. Nous avons ensuite identifié sa cible plaquettaire majeure qui est le CD36, un récepteur multifonctionnel de nature glycoprotéique capable de lier le collagène, la thrombospondine et les globules rouges infectés par le plasmodium falciparum. Enfin, nous avons montré que l’AMPc, synthétisé par des plaquettes soumises à un activateur d’adénylyl cyclase, est en partie libéré dans le milieu extra-cellulaire. Concernant le rôle de l’AMPc dans la modulation de la fonction endothéliale, nous avons démontré que les cellules endothéliales de la microcirculation pulmonaire humaine expriment aussi à leur surface une PKA. Cette enzyme dont l’activité est étroitement dépendante de l’AMPc extracellulaire, inhibe l’induction de la prostaglandine H synthétase-2 par l’ester de phorbol. Outre la caractérisation de ces activités ecto-PKA plaquettaire et endothéliale et leurs conséquences fonctionnelles, nos résultats indiquent que l’AMPc est non seulement un second messager intracellulaire mais aussi extracellulaire.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Corinne LEFAUCHEUX, I.P.
Josiane VILLENEUVE, I.P.

Chercheurs de l'unité

BENHAMOU Marc, INSERM
CHIGNARD Michel, INSERM
HATMI Mohamed, IP
PIDARD Dominique, CNRS
TOUQUI Lhousseine, IP
VARGAFTIG B. Boris, IP

Stagiaires de l'unité

AIT SAID Fatima
ALAOUI AZHER Mounia
BELLIER Lucille
CHABOT Sophie
ELALAMY Ismaïl
JACQUEMIN Claude
LE BARILLEC Karine
SALEZ Laurent

Autre personnel de l'unité

BALLOY Viviane, INSERM
BERMAN Bruce, IP
DUMAREY Claude, IP
HAVET Nathalie, IP
JOSEPH Danielle, CNRS
LEDUC Dominique, IP
LEFORT Jean, IP
MAMAS Suzanne, IP
MEMBRILLERA José, IP
NAHORI Marie-Anne, IP
RUFFIE Claude, IP
SAHLI Fatima, IP
SINGER Monique, INSERM

Publications de l'unité

98147952 – 98129714 – 98176558 – 99053433 – 98259085 – 98309473 – 98411371 – 99023815 – 98158687 – 98187951 – 98202660 – 98319529 – 99054997 – 98380108 - 98361027

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