Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Physicochimie des macromolécules biolog.

CNRS URA 1773


Responsable : BUC Henri (henribuc@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Le contrôle de l'expression des gènes requiert une connaissance du mécanisme par lequel une ARN polymérase reconnaît les promoteurs (les séquences où la synthèse de l'ARN est amorcée) et des mécanismes permettant le contrôle de l'efficacité de cette reconnaissance, soit par des protéines, soit par la structure de l'ADN. Au cours des ans, l'Unité de Physicochimie des Macromolécules Biologiques a étudié trois types de modulation de l'activité de l'ARN polymérase d'Escherichia coli : - la variation de la superhélicité de la matrice ADN ; - le contexte dans lequel se présente l'ADN bactérien : la structure du chromoïde d'Escherichia coli ; - le rôle de la protéine réceptrice de l'AMP cyclique (la CRP) dans le contrôle de la transcription. Le premier point a conduit au développement d'études de mécanique statistique prenant en compte le contexte de la séquence pour spécifier les changements structuraux de l'ADN sous l'influence de la superhélicité. Le second a permis de préciser le rôle d'une protéine majeure dans la structure du chromoïde, la protéine H-NS. A partir d'études génétiques, biochimiques et physico-chimiques, le troisième a permis de caractériser les contacts protéine-protéine esssentiels qui conditionnent l'action activatrice de la CRP lorsque son site récepteur est placé à différentes distances du démarrage de la transcription. A partir de ces travaux, nous avons été à même de décrire sur des systèmes simples comment une enzyme capable de polymériser un substrat par copie d'une matrice d'acide nucléique reconnaissait sa cible et progressait sur celle-ci. Pour comprendre les mécanismes qui sont à la base de ces phénomènes, nous avons développé des méthodologies spécifiques. Ces travaux nous permettent maintenant d'aborder les questions suivantes : - Comment fonctionne une ADN polymérase capable de recopier à la fois l'ADN et l'ARN ? - Comment fonctionnent les transcriptases inverses, et en particulier celle du VIH ? - Comment se positionnent les modules homologues des ARN et des ADN polymérases lors de la copie de leurs matrices respectives ? Les études de démarrage de la transcription s'attachent maintenant à comprendre d'autres contrôles. Elles visent en particulier à déterminer en quoi la régulation transcriptionnelle diffère lorsque l'ARN polymérase de phase stationnaire se substitue progressivement chez E. coli à l'ARN polymérase majoritaire.

Abstract

We want to understand how RNA and DNA polymerases recognize their target on the DNA and accurately copy their templates. Mechanistic studies require the development of biophysical techniques to dissect the corresponding pathways in order to complement biochemical and genetic approaches. Studies have been developed on the comparison between various E. coli RNA polymerases containing different sigma factors and the single chain T7 RNA polymerase. Activation mechanisms of the E. coli enzyme have been specified, in particular those implying the cyclic AMP receptor protein CRP in conjunction with other activators or repressors. A new mode of interaction of CRP with the sigma54 RNA polymerase has been demonstrated. When E. coli enters the stationary phase, the synthesis of a new sigma factor is derepressed and gene expression is greatly modified. A mid-range goal of our studies is to validate or disprove specific models proposed for the observed changes in regulation. Mechanistic comparisons between DNA polymerases involve mainly the Klenow fragment and reverse transcriptases. With regard to these last enzymes, recombination between RNA molecules, resulting from the transfer of the DNA copy from one template to another, has been characterised in vitro. A mechanism for termination of second strand synthesis has also been proposed for HIV-1 RT, which was also shown to adopt a telomerase-like behaviour under specific circumstances. In several instances, in vitro studies involving the interaction of a naked template with an isolated enzyme cannot completely account for function. A case which is specifically studied in our Unit is the dual role of H-NS in E. coli, a major component of the nucleoid and a pleiotropic regulator of transcription.

Texte du rapport

Reconnaissance d'un promoteur par les ARN polymérases. Modulation de la transcription. (Buckle M., Kolb A.)

La cible de l'ARN polymérase d'E. coli est une séquence comportant généralement moins de 80 paires de bases, le promoteur. La reconnaissance est lente, de 10 secondes à 20 minutes. Le temps de formation du complexe cinétiquement compétent définit la force du promoteur. Dans notre laboratoire, les méthodes suivantes ont été mises au point : a) Déformation de l'ADN. Elle est sondée par des réactifs chimiques ou nucléolytiques injectés pendant un bref intervalle de temps après le mélange ou par des réactions photochimiques qui sont instantanées. b) Etablissement de pontages entre différentes sous-unités de l'enzyme et des bases de la séquence, sélection des sous-unités impliquées, et identification du point de contact sur l'ADN. c) Déformation des sous-unités elles-mêmes (étude de la vitesse de protéolyse limitée des diverses sous-unités de l'ARN polymérase). d) Etude directe des interactions entre la protéine et une matrice immobilisée. Un schéma proposé antérieurement, qui implique deux intermédiaires, a été validé et le positionnement progressif des diverses sous-unités de l'enzyme vis-à-vis du promoteur a été précisé par ces méthodes. Il a été ensuite possible de comparer ce positionnement avec celui d'une autre ARN polymérase où la sous-unité sigma majoritaire a été remplacée par la sous-unité sigma spécifique de la phase stationnaire. Un parallèle avec la reconnaissance opérée par une enzyme plus simple, l'ARN polymérase du bactériophage T7, a été aussi mené (collaboration avec le Prof. W. McAllister, SUNY-Brooklyn). L'action de divers modulateurs de la transcription a été approfondie : facteur anti-sigma du bactériophage T4 (collaboration avec l'équipe du Prof. E. Brody (CNRS-Gif-sur-Yvette) ; action de l'activateur NifA sur l'ARN polymérase contenant le facteur sigma54 (collaboration avec M. Buck, ICSTM-Londres) ; action du répresseur NagC comme antagoniste de l'effet activateur de la protéine CRP aux promoteurs NagE-NagB (avec J. Plumbridge, IBPC-Paris). Le rôle activateur de la protéine CRP a été approfondi, soit vis-à-vis de son partenaire normal, l'ARN polymérase contenant le facteur sigma70, mais aussi vis-à-vis de l'ARN polymérase contenant le facteur sigma54 où un mode de répression original a été décrit. Le rôle activateur de FIS au promoteur TyrT a été étudié par la technique de résonance de plasmon de surface (collaboration avec les groupe de R. Kahmann à Münich et de A. Travers à Cambridge).

Structure du chromoïde d'E. coli et rôle de la protéine H-NS. (Rimsky S., Kolb A.)

La surexpression de cette petite protéine affecte gravement l'architecture globale du nucléoïde. La protéine H-NS, protéine essentielle du chromoïde, participe aussi au contrôle global de l'expression génique. La recherche s'est développée selon trois axes. 1. La recherche de mutants trans-dominants. L'analyse de leur séquence et de leur comportement a permis de définir deux domaines : un domaine N-terminal de 65 acides aminés qui intervient dans les interactions protéine/protéine, et un domaine C-terminal de 46 acides aminés, crucial dans la fixation à l’ADN. 2. La comparaison entre la protéine H-NS et la protéine StpA qui partage 80 % d'homologie avec elle (collaboration avec l’équipe de Marlene Belfort, Albany-NY). Les interactions mises en évidence in vitro sont vraisemblablement la source d'une régulation qui mobilise l'ensemble du chromoïde. 3. Une modulation de l'activité transcriptionnelle de promoteurs par l'introduction de séquences courbes en présence de la protéine H-NS. Ces études ont été poursuivies sur des promoteurs reconnus, soit par E-sigma70 et par E-sigmaS, soit par E-sigmaS seul. La capacité de ces deux enzymes à chasser des répresseurs positionnés sur l'ADN, et en particulier H-NS, s'est révélée très différente.

Des modèles structuraux aux analyses génomiques : traitements de séquences a très vaste échelle. Calculs configurationnels. (Yeramian E.)

Le travail de développements méthodologiques effectué depuis plusieurs années a conduit à la formulation de solutions générales pour préciser des modèles de structures secondaires de macromolécules biologiques. La formulation algorithmique appelée SIMEX permet de ramener le traitement d'effets à longue portée, dépendant de la longueur, à des traitements du type "proches voisins", sans aucune approximation dans la physique du problème. On peut ainsi aboutir à des réductions dans les temps de calcul pouvant aller jusqu'à 100 millions de fois. De telles analyses fournissent des informations riches et parfois inattendues sur toute une série de problèmes de biologie moléculaire (transcription, réplication, structure des gènes).

Recherches sur les transcriptases inverses. (Lavigne M., Negroni M.)

Nous avons étudié l'allongement d'amorces analogues sur des matrices identiques par plusieurs transcriptases inverses, par le fragment de Klenow, ou par des enzymes mutées, et avons pu caractériser leur fréquence de mésincorporation. Une autre grande source de variabilité chez les rétrovirus provient de recombinaisons homologues prenant place entre les deux matrices d'ARN présentes dans le virion. Un système modèle a été développé pour étudier de telles aberrations dans l'étape de saut, pour les localiser et pour calculer les fréquences associées. Cette approche permet de combiner une étude physico-chimique des événements de transfert de brins atypiques in vitro avec une approche clonale, issue de l'analyse des ADN plasmidiques amplifiés chez E. coli. Enfin, le rôle de la protéine de nucléocapside NCp7 dans ce processus a pu être précisé. L'étape de terminaison de la synthèse du deuxième brin d'ADN par la transcriptase inverse du VIH-1 a été poursuivie (en collaboration avec P. Charneau, de l'Unité d’Oncologie Virale). L'enzyme décroche de sa matrice après avoir synthétisé des séquences de type A5T2 ou A3T4. Ces séquences provoquent des déviations importantes de l'axe de la double hélice vis-à-vis de la linéarité, et compriment le petit sillon de l'ADN, deux facteurs dont le rôle a été précisé in vitro.

Enseignement
L'unité a participé au cours de "Microbiologie Générale" (Pasteur/Paris 6 et 7), et au cours "Analyse Structurale et Fonctionnelle d'un Génome" organisé par le Service d'Informatique Scientifique de l'Institut Pasteur & l'Institut Gaspard Monge de l'Université de Marne-la-Vallée.

LIENS
http://www.cnrs.fr/

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

DELPECH Odile, CNRS
TEL : (0)1 4568 8704
Télécopie : (0)1 4061 3060

Chercheurs de l'unité

BUCKLE Malcolm, CNRS
KOLB Annie, IP
LAVIGNE Marc, IP
RICCHETTI Miria, IP
RIMSKY Sylvie, CNRS
YERAMIAN Édouard, CNRS

Stagiaires de l'unité

BADAUT Cyril, Doctorant
COLLAND Frédéric, Doctorant
MOUMEN Abdeladim, Doctorant
NEGRONI Matteo, Post-doc
ORSINI Gilbert, Maître de Conf. Paris 7

PEMBERTON Iain, Post-doc
PLACE Christophe, Post-doc
SCLAVI Bianca, Post-doc

Autre personnel de l'unité

KOTLARZ Denise, CNRS
LEGAT Geneviève, IP
POLOMACK Bernadette Lucette, IP
ROUX Pascal, IP

Publications de l'unité

99079998
ADELMAN K., BRODY E.N. & BUCKLE M.
Stimulation of bacteriophage T4 middle transcription by the T4 proteins MotA and AsiA occurs at two distinct steps in the transcription cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95(26):15247-52, 1998 Dec 22.

98175458
COLLAND F., ORSINI G., BRODY E.N., BUC H. & KOLB A. The bacteriophage T4 AsiaA protein : A molecular switch for sigma70 dependent promoters. Molecular Microbiology. 27(4):819-29, 1998 Feb.

98264477
KOUZNETZOFF, A., BUCKLE, M. & TORDO N. Determination of the region of the rabies virus N protein involved in specific binding with the viral RNA. Journal of General Virology. 79 ( Pt 5):1005-13, 1998 May.

98173863
MARSCHALL C., LABROUSSE V., KREIMER M., WEICHART D., KOLB A. & HENGGE-ARONIS R. Molecular analysis of the regulation of csiD, a carbon starvation-inducible gene in Escherichia coli that is exclusively dependent on sS and requires activation by cAMP-CRP. Journal of Molecular Biology. 276(2):339-53, 1998 Feb 20

98153152
PEMBERTON I.K., BUC H. & BUCKLE M.
Displacement of viral DNA termini from stable HIV-1 integrase nucleoprotein complexes induced by secondary DNA-binding interactions. Biochemistry. 37(8):2682-90, 1998 Feb 24.

98136207
PLUMBRIDGE J. & KOLB A.
DNA bending and expression of the divergent nagE-B operons. Nucleic Acids Research. 26(5):1254-60, 1998 Mar 1.

98119821
WANG Y.P., KOLB A., BUCK M., WEN J., O'GARA F. & BUC H. CRP interacts with promoter bound s54-RNA polymerase and blocks transcriptional activation of the dctA promoter. EMBO Journal. 17(3):786-96, 1998 Feb 2.

Revues
BUC H.
L'utilisation de la résonance de plasmon de surface pour la détermination des constantes d'équilibre. REGARD SUR LA BIOCHIMIE (1998) Numéro spécial de Juin 1998

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