Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Resonance Magnetique Nucleaire (Labo De)

URA 1129


Responsable : DELEPIERRE Muriel (murield@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Les thèmes développés dans le laboratoire de RMN le sont en étroite collaboration avec les équipes de l'Institut Pasteur et sont les suivants : relations structure-fonction des molécules biologiques, reconnaissances moléculaires du type ADN-protéine, protéine-protéine ou encore peptide-macromolécules. L’orientation est plutôt d'adapter la RMN aux problèmes biologiques.

Abstract

The research area of the NMR laboratory is mainly dedicated to the structure determination of proteins, peptides and nucleic acids in solution in relation with their function but also to molecular interactions studies such as DNA-protein, protein-protein and peptides-macromolecules.Thus, the following studies have been initiated: (i) The conformational study in solution by NMR of the protein HasA from Serratia marcescens in its apo- form and by X-Ray in its holo- form. HasA is a proteineous siderophore able to bind the free heme as well as to capture it from hemoproteins; (ii) the conformational studies of scorpion venom toxins specific of potassium or sodium channels to understand their species specificity; (iii) the structural study of the Tyr tRNA C-terminal domain for which no structural information was available and that adopts a new type of fold for proteins of this family (iv) the project on DNA structure concerning the conformational study of the HIV activator domain that binds the transcription factor NF-kB and of its mutated sequence has been pursued allowing us to propose a new mode of binding; (v) the characterization of the DNA distortion in the DNA:protein complex formed with the SRY protein HMG domain and this by using phosphorus NMR; (vi) Finally, we have followed our investigations on small sample volume probes as applied to biological NMR.

Texte du rapport

Etudes structurales de l’hémoprotéine HasA et de son signal de sécrétion (Anne Lecroisey, Nadia Izadi-Pruneyre, Claire Castagné, Clarisse Deniau)

L’hémoprotéine HasA sécrétée en condition de carence en fer par la bactérie gram-négative Serratia marcescens permet à celle-ci de croître en fixant l’hème libre ou lié à une hémoprotéine. Elle est sécrétée par la voie ABC dépendante et possède un signal de sécrétion C-terminal. Après avoir étudié la structure du signal de sécrétion de HasA et déterminé les propriétés physicochimiques de HasA nous avons entrepris l’étude de sa structure. La protéine qui contient 187 acides aminés a été marquée à l’azote 15 et au carbone 13. La structure de la protéine en absence d’hème a été étudiée par RMN tandis que celle de la protéine en présence d’hème a été obtenue par diffraction des rayons X (collaboration Unité de Physiologie Cellulaire, Cécile Wandersman et laboratoire Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques Marseille, Richard Haser ).

Structures de toxines de venins de scorpions (Ada-Prochnicka-Chalufour, Alessandro Pintar, Muriel Delepierre)

Les toxines extraites de venin de scorpions sont de petites protéines connues pour affecter la perméabilité aux ions des membranes des cellules. Outre le problème de santé publique posé par les piqûres de scorpions les protéines qui composent leur venin constituent des marqueurs spécifiques de nombreux systèmes biologiques et en particulier des sondes moléculaires pour l’étude des canaux ioniques. La connaissance de la structure de ces petites molécules devrait permettre d’appréhender la sélectivité pour les différents canaux ioniques mais aussi pour les différentes espèces. Dans ce sens nous avons déterminé la structure d’une toxine longue, Cn2 (Centruroides Noxius) très active sur les canaux sodium des mammifères, et de toxines courtes spécifiques des canaux potassium (Collaboration Lourival Possani Mexique).

Etude structurale du domaine C-terminal de la tyrosyl-tRNA synthétase (Alessandro Pintar, Claire Castagné, Catherine Simenel, Ada-Prochnicka-Chalufour)

Certaines protéines qui fixent des acides nucléiques possèdent des régions qui, comme le domaine C-terminal de la tyrosyl-tRNA synthétase sont structuralement désordonnées et importantes fonctionnellement. Le rôle fonctionnel de ce désordre n’est pas encore compris.Le désordre pouvant être dynamique ou statique la RMN est la méthode de choix pour trancher. L’étude de la structure en solution du domaine C-terminal de la Tyr-tRNA marqué à l’azote-15 et au carbone-13 a montré que le désordre était statique et que ce domaine possédait une structure tertaire parfaitement définie (Collaboration H. Bedouelle Unité de Biochimie Cellulaire).

Structure de l’ADN et interactions ADN:proteine (Carine Tisné, Claire Castagné, Muriel Delepierre)

Les variations locales de la structure de l ’ADN peuvent jouer un rôle considérable dans les processus de reconnaissance en particulier avec les protéines. Bien que ces dernières années de gros progrès aient été réalisés pour essayer de comprendre les mécanismes et les bases moléculaires de la reconnaissance spécifique de l’ADN par les protéines, ce sont surtout les structures des protéines qui ont été abordées. En effet, une des difficultés majeures dans l’étude structurale des ADNs et des ARNs vient de la sous détermination du système, sous-détermination due à un manque d’information de distances pour définir la conformation du squelette. Nous avons voulu contourner cette difficulté en essayent d’obtenir ces informations via le noyau phosphore. Ainsi la structure fine du site kB du LTR du HIV a été étudiée par RMN du proton et du phosphore mais aussi par modélisation moléculaire (collaboration Brigitte Hartmann IBPC Paris). Nous étudions aussi les déformations de l’ADN dans les complexes ADN:SRY à l’aide des informations contenues dans les spectres phosphores (Collaboration Angela Gronenborn NIH Bethesda).

Méthodologie
(Muriel Delepierre)

Parmi les nombreuses méthodes spectroscopiques utilisées pour la caractérisation des molécules la RMN est de loin la moins sensible. Le manque de sensibilité de la méthode est une des raisons pour lesquelles les aimants supraconducteurs ont été développés et que des champs de plus en plus intenses sont utilisés. Une approche complémentaire et parallèle au développement des champs intenses consiste donc à optimiser les sondes afin d’en améliorer les performances et en particulier le rapport signal sur bruit pour pouvoir travailler avec des volumes plus faibles de l’ordre de 40ml. Nous avons montré qu’il était possible d’obtenir avec des nanomoles de composé des données comparables à celles obenues avec des sondes standards.

Enseignement

Le laboratoire participe aux cours du magistère de Biologie Structurale de l’ENS, du cours Pasteur, du DEA de Biochimie des protéines (Paris VI et VII) et du DEA de Biophysique (Paris VI, VII XIII Orléans).

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

LOZANO Liliane

TEL
01 40 61 37 02

FAX
01 45 68 89 29

Chercheurs de l'unité

DELEPIERRE Muriel CNRS
GUIJARRO Inaki, IP
LECROISEY Anne, IP

Stagiaires de l'unité

CASTAGNE Claire, Thèse
CLEMENT Marie-Jeanne DEA
DENIAU Clarisse, Thèse

Autre personnel de l'unité

PROCHNICKA-CHALUFOUR Ada, IP
SIMENEL Catherine, IP

Publications de l'unité

98395088
98300334
98290358
99013472
99006662
99006671
138MJ-0006

Références

Tisné, C., Simenel, C., Hantz, E., Delepierre, M. 31P Conformational studies of non-palindromic DNA duplexes related to HIV-1 enhancer. Journal de Chimie Physique (1998) 95, 412-417.

Delepierre, M.
High resolution liquid NMR and Magic Angle Spinning Journal de Chimie Physique (1998) 95, 235-240.

Wolff, N., Delepierre, M.
Conformation of the C-terminal secretion signal of the Serratia marcescens haem acquisition protein (HasA) in amphipols solution, a new class of surfactant. Journal de Chimie Physique (1998) 95, 437-442.

Delepierre, M , Roux, P., Goldberg, M., Chaffotte, A. F. 1H NMR characterization of renatured lysozyme obtained from fully reduced lysozyme under folding/oxidation conditions: A high resolution liquid NMR study at magic angle spinning. Magnetic Resonance in Chemistry (1998) 36, 645-650.

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