Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Chimie structurale des Macromolécules pour l'année 1999

CNRS URA 1129-à partir du 1er janvier 2000, URA 2185


Responsable : BÂRZU Octavian (obarzu@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L’activité du laboratoire est organisée autour de deux thématiques : a) étude des nucléoside monophosphate (NMP) kinases associée à la recherche de nouvelles cibles et à la conception de nouveaux agents antibactériens ; b) identification de protéines de fonction inconnue (YajQ) et recherche des gènes codant pour des protéines de fonction connue (déoxyribokinase) mais de gène inconnu.

Abstract

The laboratory of Structural Chemistry of Macromolecules investigates new targets for antibacterial therapy. Our activity is concentrated on proteins with known function, the nucleoside monophosphate (NMP) kinase family. Other proteins whose function is not yet known were identified by a variety of methods including genetics or proteome analysis by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.

Texte du rapport

UMP kinases
(H. Sakamoto et S. Landais)

Le gène pyrH codant pour l’UMP kinase a été identifié dans tous les génomes bactériens séquencés à ce jour. Cependant, les essais antérieurs d’isolement de l’UMP kinase de Bacillus subtilis ont échoué. Le gène pyrH de cet organisme a été cloné par PCR et l’enzyme surproduit chez Escherichia coli. Le séquençage du gène a permis de corriger deux erreurs existant dans les banques de données. A l’aide d’anticorps, l’UMP kinase a été identifiée dans le protéome de B. subtilis. L’enzyme est produit chez cet organisme à un niveau comparable à celui trouvé chez E. coli. Par contre, l’activité spécifique de l’UMP kinase de B. subtilis est vingt fois inférieure à celle de l’enzyme d’E. coli. L’analyse de mutants thermosensibles d’E. coli affectés dans le gène pyrH a été poursuivie, les sites de mutation identifiés, et les protéines recombinantes caractérisées partiellement. Nous avons montré que la thermosensibilité de ces souches est liée à une stabilité thermique réduite de la protéine, ou à un niveau de production inférieur à celui de la souche sauvage.

CMP kinases
(A.-M. Gilles en collaboration avec P. Briozzo et N. Bucurenci, J. Gallay)

La résolution de la structure tridimensionnelle de la CMP kinase d’E. coli nous a permis d’aborder l’étude de la spécificité de substrat de cet enzyme qui, chez les bactéries, phosphoryle préférentiellement le CMP et le dCMP, tandis que chez les organismes eucaryotes, il utilise indifféremment le CMP et l’UMP. L’analyse des cristaux de la CMP kinase d’E. coli en complexe avec le CDP, le CMP ou le dCMP, associée à des expériences de mutagenèse dirigée, a permis d’identifier plusieurs résidus susceptibles de discriminer les différents substrats. Il s’agit de l’Asp185 qui forme une liaison avec le sucre du nucléotide, de l’Asp132 et de la Ser36 qui interagissent avec la fonction amino du noyau pyrimidine. Plusieurs autres résidus se sont révélés être impliqués indirectement dans la catalyse via le maintien de l’intégrité structurale de la protéine.

TMP kinases
(A.-M. Gilles et L. Tourneux )

La sensibilité des bactéries envers les analogues de thymidine comme l’AZT (3’azidothymidine) varie d’une souche à l’autre. Afin de corréler l’effet antibactérien de l’AZT et leur métabolisme, nous avons surproduit la thymidine kinase (TK) et la TMP kinase de différents organismes. La TK d’E. coli et celle de B. subtilis phosphorylent l’AZT avec des vitesses comparables, mais le monophosphate correspondant (AZT-MP) est phosphorylé de manière très différente par les TMP kinases respectives. Chez E. coli, la phosphorylation de l’AZT-MP est comparable à celle du TMP. La TMP kinase de B. subtilis n’utilise pas l’AZT-MP comme substrat, d’où l’absence de sensibilité de la bactérie à l’AZT. Nous avons élargi notre étude à d’autres bactéries ou analogues de la thymidine (2’-3’didéoxythymidine, déhydrothymidine ou 6-azathymidine) et établi la relation entre l’effet toxique de ces produits et leur phosphorylation par les deux kinases bactériennes. Un mutant d’E. coli résistant à l’AZT a été identifié comme portant une insertion dans le gène tdk codant pour la TK.

Recherche sur Mycobacterium tuberculosis

Avec huit millions de nouveaux cas et trois millions de morts chaque année, la tuberculose reste un fléau déclaré urgence mondiale par l’OMS. Comme de plus, il y a émergence de souches de M. tuberculosis résistantes aux antibiotiques antituberculeux, il est important de définir de nouvelles cibles pour un traitement curatif et préventif.

  1. NMP kinases de Mycobacterium tuberculosis (H. Munier-Lehmann en collaboration avec I. Li de la Sierra, M. Delarue, C.T. Craescu)

Nos précédents résultats ont mis en évidence des propriétés biochimiques particulières et une faible homologie de séquence des NMP kinases de M. tuberculosis par rapport à leurs homologues bactériens et eucaryotes. De ce fait, et afin d’obtenir des inhibiteurs spécifiques aux enzymes de M. tuberculosis, nous avons entrepris la détermination de leur structure tridimensionnelle par RMN (adenylate kinase), ou par cristallographie (TMP kinase et CMP kinase). Quatre des cinq brins ß parallèles formant le feuillet central de l’adenylate kinase de M. tuberculosis ont la même longueur et le même arrangement relatif que chez E. coli. Le cinquième brin ß est plus court chez l’enzyme de M. tuberculosis, ce qui entraîne des réarrangements structuraux au niveau de deux hélices par rapport à l’adenylate kinase des entérobactéries. La structure 3D de la TMP kinase de M. tuberculosis sous forme de complexe avec le TMP a été obtenue à une résolution de 1.95 Å. Le repliement global de la protéine est semblable à celui des autres TMP kinases dont la structure est connue (levure et E. coli), mais des différences au niveau du site de fixation des substrats ont été observées. Une autre particularité de la TMP kinase de M. tuberculosis est la présence d’arginines aussi bien dans la P-loop (comme dans la TMP kinase de levure) que dans le domaine LID (comme dans la TMP kinase d’E. coli), qui toutes pointent vers le site actif et qui seraient impliquées dans la catalyse.

2. Recherche de nouvelles cibles chez M. tuberculosis (D. Portnoï en collaboration avec S. Memet, C. de Chastellier, M. Huerre, G. Marchal)

Les bactéries responsables de la tuberculose sont des pathogènes intracellulaires facultatifs. Bien que les macrophages alvéolaires soient les cellules hôtes principales, la capacité des mycobactéries pathogènes à envahir des cellules épithéliales est bien documentée. L’importance, lors des phases précoces de la maladie, de l’invasion de cellules habituellement non phagocytaires est en cours d’évaluation. In vivo, un modèle d’infection des souris par aérosol a été utilisé. Nos résultats suggèrent qu’effectivement des cellules alvéolaires pulmonaires habituellement non phagocytaires sont impliquées lors des phases précoces de l’infection par M. tuberculosis. In vitro, un modèle d’infection des cellules alvéolaires pulmonaires humaines A549 par des mycobactéries a été utilisé. L’invasion de ces cellules par M. tuberculosis ou par M. smegmatis complémenté par des fragments du génome de M. tuberculosis ou de M. bovis BCG est étudiée. Deux gènes candidats, qui pourraient être impliqués dans l’invasion de ces cellules par les mycobactéries pathogènes et dont le produit pourrait être une cible pour un vaccin, sont en cours d’étude.

Identification du gène codant pour la déoxyribokinase de S. typhi (A.-M. Gilles, L. Tourneux, N. Bucurenci)

A partir de la séquence N-terminale de la déoxyribokinase partiellement purifiée de S. typhimurium, nous avons identifié dans le génome de S. typhi, le gène codant pour cette protéine (deoK). Trois autres ORFs correspondant aux gènes codant pour un transporteur du déoxyribose (deoP), pour une protéine represseur (deoQ), et pour une protéine de fonction inconnue ont aussi été mis en évidence. Cette région, localisée entre les gènes uhpA et ilvN, est absente chez E. coli. La déoxyribokinase de S. typhi présente 35% d’identité avec la ribokinase d’E. coli dont la structure 3D est connue. Les comparaisons de séquence entre ces deux enzymes ont suggéré que Asn14 dans la ribokinase d’E. coli remplacé par Met10 dans la déoxyribokinase de S. typhi était à l’origine de la discrimination entre ribose et déoxyribose. La substitution par mutagenèse dirigée de Met10 par Asn dans la déoxyribokinase a diminué considérablement l’affinité pour le déoxyribose.

Electrophorèse bidimensionnelle
(C. Laurent-Winter en collaboration avec P. Bertin et J.P. Lecaer)

L’électrophorèse bidimensionnelle de par son pouvoir hautement résolutif, représente un outil de choix pour l’étude de l’expression des gènes et l’analyse de leur fonction. Dans ce cadre, l’étude des effets de la mutation du gène hns, régulateur global chez E. coli, a été poursuivie et une dizaine de nouvelles protéines dont le niveau d’accumulation est altéré dans le mutant a été identifiée dans l’extrait bactérien. L’analyse du protéome associée à une autre méthode d’approche globale (analyse du transcriptome) a permis de préciser le rôle de la protéine H-NS dans la physiologie bactérienne. Par ailleurs, dans le but d’identifier de nouvelles protéines intervenant dans le métabolisme des nucléotides, nous avons utilisé conjointement la chromatographie de pseudo-affinité sur Blue de Sépharose, l’électrophorèse 2-D, et la spectrométrie de masse. Deux nouvelles protéines (YajQ et YnaF) ont pu ainsi être mis en évidence. L’étude structurale de la protéine YajQ est en cours.

Spectrométrie de masse
(A. Namane, C. Saveanu)

L’année 1999 a été importante sur le plan de la mise au point de nouvelles méthodologies, grâce à l’acquisition d’un nouveau spectromètre de masse de type MALDI-TOF (Voyager DESTR), et d’une nanosource comme annexe au spectromètre de masse de type electrospray (API 365). Ces deux équipements complémentaires nous ont permis d’aborder l’identification des protéines à partir de gels d’électrophorèse (voir ci-dessus). Par ailleurs, nous avons approfondi l’analyse structurale des protéines isolées à partir d’extraits bactériens ou obtenues par génie génétique. L’étude de la protéine Apa, isolée de M. tuberculosis (collaboration avec l’Unité de Physiopathologie de l’Infection), a montré l’existence d’isoformes due à un degré variable de glycosylation. L’Apa recombinant, exprimé chez M. smegmatis, a révélé un profil de mannosylation différent, tandis que cette même protéine, exprimée chez E. coli était dépourvue de résidu glucidique. L’effet biologique des différentes formes de protéine a été corrélé à leur degré de glycosylation.

Par ailleurs, au cours de l’année 1999, plus de trois cents échantillons provenant des diverses unités de recherche de l’Institut Pasteur ont été analysés.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

LAMBRECHT Marie-Régine

Chercheurs de l'unité

BÂRZU Octavian, CNRS
GILLES Anne-Marie, IP
MUNIER-LEHMANN Hélène, INSERM
PORTNOI Denis, IP

Stagiaires de l'unité

BORZA Tudor, Post-doc (jusqu'au 31 juillet 2000), LANDAIS Stéphanie, Thèse (jusqu'au 31 décembre 1999), PISTOTNIK Elisabeth, DEA (à partir du 01 novembre 1999), SAVEANU Cosmin, Post-doc (jusqu'au 31 décembre 1999), TOURNEUX Lise, Thèse (jusqu'au 31 décembre 1999),

Autre personnel de l'unité

INGENIEURS :
LAURENT-WINTER Christine, IP
NAMANE Abdelkader, IP
ROUSSELLE Jean-Claude, IP (depuis le 01 novembre 1999) SAKAMOTO Hiroshi, IP

TECHNICIEN :
PISTOTNIK Elisabeth, IP (jusqu'au 15 juin 1999)

Publications de l'unité

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