Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Immunologie Virale


Responsable : Virelizier Jean-Louis (virelizi@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L'unité d'Immunologie virale etudie la relation hôte/virus dans deux infections graves et de grand impact en santé publique: l'infection VIH (SIDA), et l'infection par le cytomegalovirus (CMV).Nous analysons les bases moleculaires des strategies de persistence, et d'échappement aux reponses immunes de ces deux virus. L'analyse du controle de l'entrée des particules virales dans les cellules cibles, et de la regulation de la transcription des génomes permet de mieux comprendre la pathogenie des deux infections étudiées, et d'envisager des modes d'intervention therapeutique plus adaptés et innovants.

Abstract

The laboratory investigates host/virus relationship in two severe diseases: HIV infection-AIDS, and cytomegalovirus (CMV) infection. The aim of these approaches is to analyse the molecular basis underlying the strategies of persistence and escape of the two viruses investigated, in order to better understand the pathogenesis of the respective infections in man, and design better adapted, innovative modes of therapeutic intervention.

Texte du rapport

Approches générales de l’unité

L’unité d’Immunologie Virale a poursuivi ses approches de recherche sur la Relation Hôte / Virus. Notre but est :

Ces approches nous ont amené à intriquer des concepts et des méthodologies relevant tout autant de la virologie que de l’immunologie, et de la biologie cellulaire tout autant que de la proteinologie. Pour ce faire , nous avons regroupé des chercheurs venant d’horizons differents , tels que l’immunologie clinique et fondamentale (F.Arenzana-Seisdedos, J-L Virelizier), la virologie (S.Michelson), ou la biologie moléculaire (F. Bachelerie), mais aussi de tisser des collaborations multiples, rendues décisives par la variété des compétences nécessaires: certaines ont été institutionalisées à travers deux Actions Concertées européennes consecutives, que nous avons coordonné: (St Andrews, Ecosse- Hopital 12 Octobre, Madrid- Institut Curie, Paris). D’autres ont été essentielles au moment où nous abordions le domaine nouveau des chimiokines (Institut Theodor-Kocher, Berne - Université de Vancouver, Canada). Enfin des fructueuse collaborations ont été génerées à l’institut Pasteur même, dans notre département (équipes de J-M Heard, Muriel Delepierre, B.Hurtrel, L.Montagnier), ou dans d’autres départements (équipes de F.Baleux , B.Friguet), et aussi l’IP du Cambodge. A l’intérieur même de notre unité, les deux équipes identifiées (HIV, dirigée par F.Arenzana-Seisdedos, et CMV, dirigée par S.Michelson)) se sont mutuellement enrichies d’approches complémentaires ou parallèles: c’est clairement le cas pour nos recherches sur les récepteurs aux chimiokines, où l’échange a été particulierement fructueux. C’est vrai également pour l’étude de la régulation de fonctions cellulaires par des gènes non structuraux des virus, et celle du controle de la transcription des génomes viraux par des proteines cellulaires. Cette attitude a généré dans le laboratoire des échanges nombreux entre chercheurs, stagiaires et techniciennes, et une coopération permanente de tous.

I- Recherche sur le Cytomegalovirus humain (CMV)

Le cytomégalovirus humain (CMV), un beta herpesvirus, nous sert comme modèle d’étude des relations virus-hôte. Nous étudions les modifications du comportement de différents type cellulaire induites par différentes protéines virales, exprimées soit au moment de leur pénétration dans la cellule avec l’inoculum viral, soit pendant la transcription/traduction intracellulaire du génome viral. Comme avec les autres virus herpes, le cycle viral se déroule en trois phases: la phase très précoce (IE) pendant laquelle un petit nombre de protéines, pour la plupart transactivatrices, sont élaborées; la phase précoce (E) qui voit l’apparition des enzymes et des protéines nécessaires à la synthèse de l’ADN viral; et la phase tardive (L) qui débute avec cette synthèse et pendant laquelle sont fabriquées la majorité des protéines structurales du virion. In vivo, le cycle viral peut s’arrêter et rester suspendu à n’importe quel stade avant la synthèse d’ADN viral, c’est-à-dire pendant les phases IE ou E. In vivo , le CMV infecte et/ou se réplique dans une grande variété de types cellulaires (neutrophiles, monocytes/macrophages, cellules épithéliales et endothéliales). La latence virale, établie à la suite de la primo-infection, s’installe principalement dans les cellules endothéliales et les monocytes, quoique bien d’autres types cellulaires puissent contenir des marqueurs du virus chez le porteur sain. La primo-infection par le CMV est habituellement inapparente sur le plan clinique. A la suite de cette infection, le CMV devient un résident permanent de son hôte. Lors d’une immunodépression iatrogène ou spontanée de l’hôte, le CMV peut se réactiver et entraîner une importante morbidité et mortalité. Parmi les manifestations cliniques, on observe des malformations congénitales qui se traduisent par un retard psychomoteur et une surdité, des mononucléoses infectieuses, des maladies chroniques greffon-contre-hôte chez les transplantés d’organe et des pneumonies interstitielles chez les greffés de la moelle osseuse. Un des aspects importants, mais mal connus, qui à lieu pendant la phase aîgue de l’infection est une immunodépression profonde et globale (revue dans [1]). Cette immunodépression ne peut s’expliquer par l’infection et la destruction de cellules du système immunitaire, car même si le CMV infecte les monocytes et les neutrophiles, il n’y s’exprime pas et il ne se réplique pas dans les lymphocytes. Ce paradoxe nous a évoqué la possibilité que l’entrée du virus lui-même pourrait altérer le comportement de la cellule. Effectivement, le virion comporte quelque 35 protéines virales, mais aussi des protéines provenant de la cellule (b2-microglobuline, protéines du système du complément (CD55 et CD59), annexine II, actine).

Nous avons donc étudié des modifications métaboliques de la cellule à la suite du contact avec le virus, mais précedant toute expression du génome viral. Nous avons constaté (1995), que la synthèse des protéines cellulaires est inhibée à 90% dans les 5 minutes qui suivent le contact entre virus et cellule inhibition qui dure plusieurs heures avant de rattraper le niveau de la cellule non-infectée. Cette inhibition est provoquée par des particules CMV inactivées par les rayons UV ou par la chaleur, ce qui démontre clairement le rôle des protéines de l’inoculum dans ce phénomène. L’addition de virus purifié à un système de traduction in vitro a confirmé l’effet suppressif des protéines de l’inoculum sur la synthèse de protéines. Enfin, un rôle de la protéine structurale pp65, qui composé 15% du virion, a été impliqué dans cette inhibition. Nous avons aussi constaté (1996) qu’il y avait une hypophosphorylation des protéines cellulaires dans les 5 minutes après le contact entre virus et cellule qui ne durait que 30 minutes. Cette observation nous a incité à rechercher la présence de protéine- phosphatases au niveau du virus purifié, puisque cette hypophosporylation était inhibé par traitement de l’inoculum avec un inhibiteur spécifique de sérine/thréonine phosphatases. Nous avons détecté par immunoblot et des études biochimiques la présence des sérine/thréoine phosphatases PP2A et PP1 à l’intérieur des particules du virus purifié. Comme le génome du CMV ne contient pas de gènes homologues à ces phosphatases, nous avons postulé que le virus incorpore ces phosphatases au moment de son enveloppement. Afin de confirmer cette hypothèse, nous avons tranfecté stablement des cellules avec la sous-unité catalytique « taggée » de la PP2A. Le CMV produit sur ces cellules contenait la PP2A taggée, ce qui démontre l’origine cellulaire de cette phosphatase dans le virion. Donc, le CMV peut non seulement incorporer une enzyme d’une cellule, mais aussi le transmettre sous une forme active à une autre cellule, et ce phenomène nouveau pourrait participer aux profondes modifications de la compétence immune observées au cours de la primo-infection à CMV. On sait que la majorité des particules de CMV produites sont défectives pour la réplication, et que même les particules potentiellement infectantes ne se repliquent activement (cycle complet) que dans de rares cellulules permissives.L’observation que des virions CMV peuvent modifier des cellules en l’absence de toute replication peut rendre compte de l’intensité des modifications metaboliques observées au cours de la primo-infection, puisque les modifications peuvent concerner un nombre de cellules beaucoup plus grand que celui des cellules répliquant activement le virus.

En complément de ces études métaboliques, nous avons recensé, au microscope électronique, (en collaboration avec le Dr. André Topilko, IP), les constituants de l’inoculum viral et réalisé une étude cinétique des toutes premières interactions du CMV avec les fibroblastes humains, cellules hôtes utilisées pour les études métaboliques. Nous avions observé (1994) que l'inoculum viral, tel qu'il est utilisé en routine, est composé de plusieurs types de particules enveloppées : particules complètes à noyau dense (33 %), particules incomplètes à noyau translucide appelées NIEPs (8%) et corps denses (50%). Ces derniers sont des gouttes de protéines virales entourées de la même enveloppe que les virions, mais dépourvues d'ADN viral. Ces corps denses sont composés à 95 % de la seule protéine pp65; il est donc peu surprenant que cette protéine semble jouer un rôle dans l’inhibition de la synthèse protéique cellulaire rapportée ci-dessus. De plus, l’immunofluorescence a révélé que cette protéine se transloque dans le noyau cellulaire en moins de 10 minutes après le contact du virus avec la cellule. Nous nous sommes demandé si toutes ces particules pénétrent la cellule et, si oui, avec quelle cinétique. Nous avons montré par des études cinétiques au microscope électronique que le virion du CMV s’adsorbe et pénètre en moins d'une minute au sein des fibroblastes par fusion de l'enveloppe virale avec la membrane plasmatique de la cellule. La nucléocapside se trouve libre dans le cytosol et se localise tout prés du noyau au bout de 15 minutes. Les corps denses rentrent dans le fibroblaste de la même manière et avec la même cinètique que les virions (1994-2). Ce mode d’entrée semble très efficace, car 100% des cellules infectées exprime les protéines IE 4 heures après contact avec le virus. Néanmoins l’entrée du virus par fusion semble être unique aux fibroblastes. Nos études cinétiques et morphologiques de l’entrée des particules dans les cellules humaines endothéliales et épithéliales pigmentées de la rétine montrent que le virus y entre par endocytose et non par fusion (manuscrit soumis à la publication). Le virus se trouve ensuite amassé dans des vacuoles où il semble y avoir une dégradation de l’enveloppe. Par contraste avec les fibroblastes, on ne voit jamais la nuclécoapside libre dans le cytosol. Le taux très faible d’expression virale dans ces cellules (5 % à 15%), même après infection à très haute multiplcité d’infection, pourrait donc s’expliquer par l’emprisonnement et la dégradation du majorité des particles dans des vacuoles. En collaboration avec Jean Salamero (Institut Curie) nous essayons actuellement de préciser les voies d’entrée empruntées par le CMV et la nature des vacuoles où se concentre le virus.

Le CMV doit maintenir une relation équilibrée avec son hôte au niveau cellulaire aussi bien qu’au niveau de l’organisme entier, car le virus n’est jamais complètement éliminé, bien que sa réplication soit finement contrôler chez l’individu immunocompétent. Il n’est donc guerre surprenant que le CMV ait developpé de nombreux moyens d’échapper à la surveillance immune. Parmi ces moyens, figurent la régulation négative de l’expression des molécules d’HLA classe I et classe II à la surface des cellules infectées, la perturbation du système de complément, et la modulation des récepteurs Fc sur le virion et les cellules infectées (revues* dans [3]). Mais un autre moyen consiste dans la régulation de la production de cytokines et de chimiokines. Ce moyen est d’autant plus important que souvent une expression minimale du virus suffit à déreguler ce système de médiateurs solubles, sans que le virus se réplique complètement (1998). Dans ce domaine, nous avons poursuivi nos observations précédentes sur l’induction du “ Fibroblast Growth Factor “ (FGF-2) (Alcami et al, 1991, 1993) par des études non seulement de l’induction et de la régulation négative de la production de médiateurs solubles par le CMV (1994-3, 1996-5, 1997-2, 1998-1, 1999-2), mais aussi de l’effet de médiateurs solubles sur la réplication virale (1999-1, 1995-1). Nous avons montré que l’infection des fibroblastes par le CMV induit une surproduction du “transforming growth factor b1” (TGFb1) due à une activation des 2 promoteurs dans le gène codant pour ce facteur, suivi d’une augmentation de sa transcription (1994). De par cette induction, le CMV peut stimuler sa propre réplication, puisque nous avons montré auparavant que le TGFb1 augmente la réplication du CMV (Alcami et al, JGV 74: 296, 1993). L’activation du promoteur du TGFb1 est médiée par l'interaction de la protéine IE2 du CMV et le facteur de transcription erg-1 (1996). Le promoteur du TGFb1 ne comportant pas de boîte TATA classique; c’etait la première fois que l’on démontrait l’activation d’un tel promoteur par la protéine IE2* et l’interaction de cette protéine avec ce facteur de transcription.

Le génome du CMV, constitué d’une molécule d’ADN double brin, linéaire de 234 kilo paires de base, code pour plus de 200 protéines. Parmi ces gènes figurent 3 séquences, désignés US27, US28 et UL33, qui montrent une homologie à des protéines transmembranaires couplés au protéines G. Ce type de protéine virale est semblable aux récepteurs des chimiokines. Nous nous sommes demandés quel est l’effet de l’infection par le CMV sur la production de chimiokines. Puisqu’un des gènes ( US28) a été décrit comme un récepteur fonctionnel de CC chimiokines dans des cellules transfectées, nous avons étudié l’effet de l’infection sur la production des CC chimiokines RANTES et MCP-1 après infection des fibroblastes de la peau. Le CMV induit la production de RANTES, mais cette chimiokine n’est plus détectée dans le milieu extracellulaire à des temps tardifs après infection (1997). De même, la CC chimiokine MCP-1, qui est produite de façon constitutive par les fibroblastes, disparaît du milieu des cellules infectées. L’analyse par RT-PCR des transcrits de RANTES et de MCP-1 a écarté la possibilité d’un arrêt de la transcription de ces protéines. En même temps, l’immunofluorescence intracellulaire montre que la chimiokine RANTES s’accumule à l’intérieur de la cellule infectée en parallèle à sa disparition du milieu externe. Ces observations nous ont amené à étudier le rôle possible des récepteurs de chimiokine codés par le CMV dans la disparition de RANTES et de MCP-1. Une étude cinétique de la transcription des 3 gènes homologues aux récepteurs de chimiokine, US28, US27 et UL33, a montré que la transcription de l’UL33 et de l’US27 ne commence qu’après la synthèse d’ADN viral, tandis que la transcription de US28 démarre dès 8 heures après infection et s’accroît tout le long du cycle viral (1997 et 1998). Des études par RT-PCR ont montré que l’ARN messager d’US28 est présent dès 2 heures après infection et ceci même dans les cellules non-permissives pour la réplication complète du virus (1999-1). En collaboration avec le Dr. T. Jones (USA) nous avons utilisé des virus mutants, délètés de ses gènes US28, ou US27 ou des 2 gènes ensemble. Nous avons étudié la production extracellulaire de RANTES et MCP-1 dans les fibroblastes infectés par ces différents mutants. La production extracellulaire de ces chimiokines n’était pas affectée lorsque les cellules étaient infectées par un CMV délété de l’US28 ou délété à la fois de l’US28 et de l’US27. Puisque le seul récepteur potentiel subsistant dans le CMV délété de l’US28 et de l’US27 est le gène UL33, cette protéine ne peut donc pas être impliqué dans la sequestration de RANTES et de MCP-1. L’ensemble de ces observations montrait une accumulation intracellulaire de RANTES et MCP-1 au cours de l’infection par le CMV et une déplètion extracellulaire de ces chimiokines qui est directement liée aux récepteur viral US28. Cependant, la question se posait de savoir si cette accumulation intracellulaire était due à un blocage des chimiokines à fur et au mesure de leur synthèse, ou à leur internalisation rapide et continuelle du milieu extérieur. Effectivement, Amara et al (J. Exp. Med. 186: 139, 1997) dans notre laboratoire avait montré qu’après le contact du récepteur CXCR4 avec son ligand SDF-1, ou de CCR5 avec son ligand RANTES, le récepteur était internalisé par endocytose, puis recirculait vers la surface cellulaire. Afin d’éclaircir ce point vis-à-vis du CMV, nous avons ajouté la proteine RANTES biotinylée (RANTES-B) de façon exogène aux cellules infectées soit par le CMV parental, soit les virusdélétés des gènes de recepteurs aux chimiokines. Après lavage et lyse des cellules, l’analyse en immunoblot à montré une accumulation intracellulaire de RANTES-B dans les cellules infectées par le CMV parental, mais aucune incorporation dans les cellules infectées avec le virus délété des deux récepteurs US28 et US27, ni dans les cellules non-infectées. Par contre, il y avait une incorporation de RANTES-B dans les cellules infectées soit par le virus délété de l’US28, soit par celui délété de l’US27. Nous avons donc pu montrer que la protéine codée par le gène US27 est également un récepteur fonctionel d’au moins une CC chimiokine (1998). Globalement, nos résultats mettent en évidence un mécanisme nouveau par lequel le CMV pourrait se mettre à l’abri d’une surveillance immunitaire : la séquestration de CC chimiokines de l’environnement de la cellule infectée. Cette strategie virale pourrait à la fois bloquer l’infiltration de lymphocytes aux sites d’infection, et empêcher l’activation de lymphocytes se trouvant déjà sur place, puisque ce sont là des fonctions connues des chimiokines. Ce mechanisme d’échappement serait original: il serait indépendant de la géneration d’une réponse immune spécifique systèmique, mais la rendrait inefficace par défaut de recrutement des cellules effectrices au niveau des sites de replication virale, le virus passant dès lors « inapperçu ».

Quoique le CMV emploie de multiples mécanismes pour échapper aux réponses immunitaire à mediation cellulaire, sa réplication reste pourtant susceptible dans une certaine mesure au contrôle par les cytokines inflammatoires, notamment les interférons (IFN) g et b (revue dans “ouvrages” 1998). Nous avons décidé d’explorer les effets de différents cytokines sur la réplication du CMV dans un modèle pertinent à la situation in vivo , notamment dans les cellules épithéliales pigmentées de la rétine humaine, désignées ici “cellules RPE”. Le CMV est la cause de rétinite sévère , cause de cécité chez les patients atteints de SIDA (revue : Jabs & Quinn dans “ Ocular Infection and Immunity ”, 1996), mais on connait mal les interactions cellules RPE / CMV. Ces cellules forment la couche la plus externe des 10 couches de la rétine et servent à phagocytoser, et ainsi renouveller, les sègments extérieurs des photorécepteurs. Les cellules RPE sont les dernières à être atteintes lors de la progression d’une rétinite à CMV et l’on soupçonne l’établissement de la latence virale à ce niveau après une thérapie anti-virale. Nous avons d’abord étudié l’effet de TNF, IL1b, IFN-g, IFN-b ou TGFb2 qui sont présents dans l’œil à l’état normal ou pendant une inflammation. Seuls les IFN régulaient négativement cette réplication et bloquait le cycle viral à un stade après l’expression des protéines très précoces virales. Dès l’arrêt du traitement par l’IFN, la réplication virale reprend, ce qui montre la conservation d’un génome actif du CMV dans les cellules RPE en présence d’IFN (1999) Nous avons voulu approfondir le mécanisme de cette inhibition par les IFN. Il est connu depuis longtemps que l’IFN-g inhibe la réplication du CMV, mais les mécanismes de cette inhibition n’étaient pas éclaircis (revue dans “ouvrages” 1998). L’IFN-g induit la production de l’indoléamine-2,3-dioxygénase (l’IDO), une enzyme responsable de la conversion de l’acide aminé essentiel tryptophane en kinéurinine. La déplétion de tryptophane entraîne l’inhibition de certains parasites notamment le Toxoplamosa gondii et le Chlamydia psittaci (Malina & Martin Graefe’s Arch Clin Exp Ophthalmol. 231 : 482, 1993, Nagineni et al, Infect. Immunity 64 : 4188, 1996). Nous nous sommes demandés si ce même mécanisme intervenait dans l’inhibition de la réplication du CMV par l’IFN-g, car dans ce cas l’addition de tryptophane au milieu de culture devrait permettre la réplication dans les cellules traitées par l’IFN-g. Effectivement, l’addition de tryptophane au milieu corrigeait d’une manière dose-dépendante l’inhibition de la réplication induite non seulement par l’IFN-g, mais aussi par l’IFN-b (1999). Lorsque les cellules RPE sont traitées simultanément par l’IFN et IL-1b, il y a une induction de monoxyde d’azote synthase de type II (NOSII). L’addition de donneurs exogènes de monoxyde d’azote aux cellules RPE inhibe la réplication du CMV. Pourtant, nous avons montré que le CMV bloque l’activité de cette enzyme, inhibant ainsi la production de monoxyde d’azote (1999). L’ensemble de ces résultats suggèrent que, lors d’une inflammation quand l’IL-1b et l’IFN-g sont présents ensemble, le CMV peut combattre la production de monoxyde d’azote en bloquant l’activité de la NOSII, mais ne peut surmonter le block imposé à sa réplication par la privation en tryptophane médiée par l’IDO. Ces données experimentales, obtenues sur un type cellulaire pertinent vis-à-vis de la rétinite à CMV, suggèrent un role de l’immunité cellulaire non-cytolytique, dépendant de la secretion d’IFNg , dans les défenses de l’hôte contre l’infection de la rétine par le CMV, mais indiquent aussi que le virus peut utiliser un mechanisme d’échappement remarquablement adapté à cette réponse.

II- Recherche sur le VIH

L’infection VIH pose au thérapeute de nombreux problèmes, que l’incontestable progrès apporté par les antiviraux associés n’a toujours pas résolu. D’une part, la protection contre l’infection experimentale par SIV reste trés difficile à obtenir, faisant redouter de grandes difficultés dans la production d’un éventuel vaccin chez l’Homme. D’autre part, les antiviraux permettent de diminuer efficacement la replication virale, mais ne permettent pas d’éradiquer l’infection VIH. Dans les jours qui suivent l’arrêt de chimiotherapies « efficaces » et prolongées pendant une ou deux années, la replication du VIH reprend avec la même cinétique et intensité qu’au cours de la primo-infection initiale. Ceci indique que la stratégie de persistence de ce lentivirus n’est pas efficacement contrecarrée par nos thérapeutiques actuelles, et suggère que l’immunité spécifique générée au cours de la longue période de réplication précedent le traitement anti-retroviral ne permet pas non plus de contenir le rebond de l’infection. Dans ces conditions, il est légitime de reconsiderer nos concepts sur les moyens de défense de l’organisme contre le VIH, et d’envisager que le contrôle relatif mais incontestable de la réplication virale observé après la primo-infection et pendant les années qui précèdent le SIDA soit plus le fait de cytokines produites en réponse (spécifique et non spécifique) à l’infection que de la production d’anticorps ou d’effecteurs cytotoxiques. Ceci amène à envisager que la réplication du VIH pourrait être largement auto-limitée, grâce à l’induction de cytokines et de chimiokines limitant le nombre de cellules-cibles disponibles, ou de « facteurs suppresseurs » limitant la transcription du génome VIH intégré (voir la revue Virelizier, 1998). Il est donc important de tenter de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la relation hôte / VIH, afin de tenter de s’opposer à la transcription et la dissemination du virus de façon novatrice et adaptée. Dans le domaine des relations du VIH avec les cellules hôtes notre travail a été mené sur deux axes de recherche. D’une part, nous avons poursuivi l’étude des mécanismes d’activation de NF-kB et le rôle que ce facteur joue dans la réactivation du génome du VIH dans les lymphocytes T normaux. Plus particulièrement, nous avons étudié le métabolisme de l’inhibiteur IkBa qui régule l’activation et la distribution sub-cellulaire de NF-kB, et les conséquences fonctionnelles de sa localisation nucléaire. D’autre part, nous avons abordé l’étude du rôle des co-récepteurs de l’entrée du VIH et les effets inhibiteurs de chimiokines spécifiques de co-récepteurs sur la réplication du VIH.

A-. Activation cellulaire et réplication du VIH: Rôle des facteurs de transcription NF-kB. Etude de leur régulation.

Les facteurs de transcription NF-kB sont retenus dans le cytoplasme sous une forme inactive liées à des protéines inhibitrices dont la principale et la mieux étudiée est IkBa. L’activation de NF-kB implique la modification de la protéine inhibitrice par des changements post-transductionnels qui la rendent susceptible à la dégradation protéolytique. Les complexes NF-kB ainsi libérés de leur inhibiteur et exposant des signaux de transport nucléaire (NLS), sont acheminés vers le noyau par un transport actif.

1- Rôle de facteurs NF-kB dans la réactivation de provirus infectieux dans les lymphocytes T.

En dépit de l’abondance de suggestions sur le caractère important de la participation de l’« enhancer » du VIH à l’induction du LTR par des signaux extracellulaires, son rôle et son importance dans la réplication du VIH sont restés très longtemps débattus, voire contradictoires. Afin de répondre à cette question, nous avons procédé à la mutation de séquences consensus de NF-kB dans des clones moléculaires infectieux VIH-1. Des provirus ainsi développés ont été transfectés dans des lignées de cellules transformées. Des particules infectieuses sauvages ou mutées, ayant une infectivité comparable, comme en témoigne l’accumulation d’ADN proviral rétrotranscrit, furent ainsi produites et utilisées dans l’infection de lymphocytes T CD4 au repos isolés du sang. Dans cet environnement cellulaire et contrairement à ce qui est le cas dans les cellules T transformées, la présence d’un « enhancer » fonctionnel confère aux viraux sauvages un avantage de réplication très marqué. En effet, l’activation de lymphocytes T par différents stimuli mitogéniques (anticorps anti-CD3, phytohémagglutinine, phorbol esters) permet la propagation de virus sauvages qui est détectable par l’accumulation d’ADN proviral, de transcrits et antigènes viraux. En revanche, aucun signe de transcription et réplication est détecté dans les cellules infectées avec les virus mutés (Alcami et al, EMBO J. 14: 1552-60). Ces résultats ont été confirmés récemment par le groupe de David Baltimore. Nous concluons que les facteurs NF-kB jouent un rôle prépondérant et sine qua non dans la connexion des voies d’activation cellulaire à la machinerie qui permet l’initiation de la transcription et la réplication du VIH dans les lymphocytes T non transformés, cellules plus pertinentes à la pathogénèse de l’infection VIH que les lignées lymphoblastoides, où l’induction de NFkB n’est pas indispensable à la stimulation de la transcription virale.

2- Activation de NF-kB par la réplication du VIH dans les monocytes/macrophages et auto-perpetuation de la transcription virale.

Certaines cellules de lignée monocytaire répliquent activement le VIH en absence apparente de signaux extracellulaires. C'est le cas en particulier de certaines cellules de la microglie du cerveau, où la transcription et la réplication virale est clairement démontrable sur des autopsies de patients, et dès les premiers jours de l'infection intraveineuse expérimentale de macaques par le SIV. Nous avons montré par le passé que l'infection par le VIH dans les monocytes induit l’activation de NF-kB et de l'enhancer viral et amorce et la transcription du provirus VIH, créant ainsi une boucle d'amplification avec le transactivateur viral Tat qui pourrait contribuer à la réplication soutenue et autonome des VIH dans ces cellules (Bachelerie et al, Nature, 1991). Il nous restait à démontrer formellement que l’occupation des séquences enhancer par l’hétérodimère p50/p65 (NF-kB) était déterminante non seulement pour l’initiation de la transcription, mais aussi pour le maintien de la réplication observée dans les monocytes humains. Nous avons utilisé des cellules monocytoïdes infectées chroniquement sous forme productive (U937) ou latente (U1), pour démontrer la corrélation existant entre la localisation nucléaire de NF-kB et la transcription du provirus VIH intégré. La translocation nucléaire permanente de NF-kB induite par la réplication chronique du VIH dans les monocytes peut être interrompue par l’addition dans le milieu de culture d’un inhibiteur (peptide aldéhyde Carbobenzoxyl-leucine-leucine-leucinal, MG132) de l’activité protéolytique du protéasome. L’interruption de l’activation de NF-kB dans les cellules chroniquement infectées abolit, dans les heures qui suivent, la transcription permanente du provirus VIH intégré, mesurée par des techniques de run-off de transcrits nucléaires viraux. En outre, nous avons muté les séquences consensus pour NF-kB dans un provirus VIH infectieux Ce provirus muté s’avère incapable de répliquer dans les monocytes U937 alors qu’il garde une capacité notable à le faire dans une lignée lymphoblastoïde T (CEM) où la contribution de facteurs NF-kB à la réplication du VIH est moins importante. Nos résultats indiquent que l’activation de facteurs NF-kB dans les monocytes induite par la réplication du VIH, contribue substantiellement à la transcription de son génome et le maintien de sa réplication active (Jacqué et al, 1996).L’auto-perpetuation de la transcription du VIH dans les cellules de lignée myelo-monocytaire pourrait être un élement important de la stratégie de réplication active permanente du VIH.

3- Régulation de l’activation de NF-kB. Métabolisme et localisation nucléaire d’IkBa.

Dans ce domaine nous avons caractérisé les modifications post-transductionnelles (phosphorylation et ubiquitination) et les signaux structuraux (domaine carboxyl-terminal) qui permettent la dégradation d’IkBa susceptible nécessaire à la libération de facteurs NF-kB. Nous avons montré que, outre les fonctions bien connues qu’elle exerce dans le cytoplasme, la protéine IkBa régule les fonctions de NF-kB (activité et trafic) dans le noyau cellulaire.

a-La conjugaison d’ IkBa avec des multichaînes d’ubiquitine détermine l’attaque protéolytique par le protéasome.

Comme conséquence de l’activation cellulaire par des stimuli très divers, deux sérines (Sérines 32 et 36) de la protéine IkBa sont phosphorylées. La mutation de ces sérines en alanine rend la protéine résistante à la dégradation et bloque l’activation de facteurs NF-kB. Les protéines mutées se comportent alors comme des transdominantes négatives de la transcription dépendante de NF-kB. Nous avons observé que la phosphorylation d’IkBa s'accompagne de l’apparition de formes de la protéine conjuguées de manière covalente à des chaînes d’ubiquitine (Rodriguez et al, Oncogene 1996). Nous avons identifié les lysines sur lesquels se produit l’ubiquitination de la protéine. Deux sites majeurs (K21 et K22) et deux accessoires (K38 et K47), ont été identifiés. Nous avons montré que la mutation des Sérines 32 et 36 empêche l’attachement covalent d’ubiquitines. La phosphorylation d’IkBa est donc requise et précède l’action des enzymes E2-E3 qui permettent la ligation d’ubiquitines au substrat, IkBa. Nous avons enfin montré que la protéine IkBa ainsi modifiée deviens une cible de l’attaque protéolytique par le protéasome. La spécificité de la dégradation d’IkBa par le protéasome a été confirmée par l’utilisation de peptides inhibiteurs carbobenzoxyl-leucine-leucine-leucinal qui bloquent sélectivement l’activité catalytique du complexe.

b- Dégradation d’IkBa: le rôle de la région carboxy-terminal..

Nous avions les premiers rapporté que, outre les modifications du domaine amino-terminal d’IkBa, la présence d’un domaine de 60 résidus à l’extrémité COOH était nécessaire à la dégradation inductible d’IkBa aussi bien dans les cellules intactes que in vitro. Nos résultats prouvaient que la dégradation d’IkBa n’était pas conditionnée à l’intégration de l’inhibiteur dans un complexe hétérotrimérique avec NF-kB. La capacité du domaine COOH terminal à fonctionner per se comme un signal de dégradation a été recherché. A ces fins, nous avons développé des protéines chimères formées d’une protéine à demi-vie longue, beta-galactosidase, fusionnées aux domaines NH2 et/ou COOH d’IkBa. La dégradation de la protéine chimère est obtenue dans les cellules intactes si elle porte en cis les deux régions amino et carboxy terminales d’IkBa. Cependant, in vitro la présence de la région COOH-terminal suffit à rendre IkBa susceptible à la dégradation par le complexe muticatalytique 20S du protéasome. Ces résultats montrent que des signaux de dégradation inductibles (NH2) et constitutifs (COOH), co-existent dans la protéine IkBa et sont transférables à d'autres protéines (Kroll et al, Oncogene, 1997). Notre interprétation de ces résultats est la suivante: l’ubiquitination d’IkBa dans son domaine amino-terminal permettrait l’interaction avec le complexe 26S du protéasome. Après dé-ubiquitination de la protéine par l’action d’hydrolases spécifiques, l’interaction physique d’IkBa avec les sous-unités du complexe mutlticatalytique 20S du protéasome serait assurée par le domaine COOH. Nos résultats les plus récents valident nos hypothèses. En effet, nous avons prouvé par des expériences d’immunoprécipitation l’interaction physique entre le protéasome 20S et IkBa qui requiert la présence du domaine COOH de l’inhibiteur. Nous avons mis au point un ELISA qui nous a permis de déterminer les constantes d’affinité d’IkBa ou des protéines hétérologues chimériques portant le domaine carboxy-terminal de l’inhibiteur (en préparation).

c-Localisation nucléaire d’IkBa et conséquences fonctionnelles sur la transcription dépendante de NF-kB.

Nous avons montré (Arenzana-Seisdedos et al, Mol. Cell. Biol., 1995) qu’à la suite de l’activation cellulaire, la protéine IkBa synthétisée de novo s'accumule rapidement dans le noyau. IkBa possède la capacité de dissocier in vitro les complexes de NF-kB de l’ADN auquel il sont liés. Utilisant des signaux extracellulaires qui stimulent l’activation transitoire de NF-kB, nous avons prouvé que l’accumulation de la protéine IkBa peut inhiber l’interaction NF-kB/ADN dans les noyaux de cellules activées et bloquer ainsi la transcription (effet de terminaison). La formation de complexes IkBa/NF-kB dans le noyau s’accompagne d’une diminution de l’activité NF-kB et la disparition progressive du noyau de ces facteurs de transcription. Ces résultats constituent la première mise en évidence de la localisation et du rôle fonctionnel d’IkBa dans le noyau cellulaire. Des résultats obtenus par l’équipe de D. Baltimore avec des souris IkBa « knock-out », ont confirmé et validé nos observations. Nos travaux plus récents montrent que la persistance de l’activité NF-kB dans le noyau nécessite la dégradation d’IkBa dans ce compartiment cellulaire. Les mécanismes qui permettent cette dégradation sont actuellement analysés.

d- Identification de b-TrCP comme le facteur qui permet la réconnaissance spécifique d’ IkBa et par la machinerie d’ubquitination..

b-TrCP est une protéine humaine ayant une boîte de type F et un composant de complexes Skp1-Cullin-F-box-protein (SCF), une classe nouvelle de ligases d’ubiquitine de type 3 impliqués dans la dégradation de différentes cyclines. b-TrCP est un facteur qui régule la dégradation de CD4 par la protéine Vpu du VIH avec qui elle s’associe. Nous avons montré que b-TrCP est nécessaire à la dégradation d’IkBa. b-TrCP forme des complexes uniquement avec les formes d’IkBa portant de phosphosérines dans les résidus S32 et S36. Des mutants d’IkBa portant des substitutions S32A et S36A sont ainsi non phosphorylables et incaples de se lier à b-TrCP. Une variante de b-TrCP portant une délétion de la boîte F, qui permet son interaction avec Skp1, se comporte comme un transdominant négatif de l’activation de NF-kB. L’expression de ce mutant stabilise et accumule des formes phosphorylées d’IkBa et empêche la translocation de NF-kB vers le noyau. Ces résultats indiquent que b-TrCP est un composant essentiel dans la reconnaissance d’IkBa par la machinerie d'ubiquitination qui précede sa protéolysis par le protéasome (Kroll et al, J. Biol. Chem.,1999).

e- IkBa possède un signal d’export nucléaire.

Par microinjection de protéines recombinantes dans le noyau d’oocytes de Xenopus nous avons pu montrer que les protéines IkBa isolées ou associées à NF-kB quittent le noyau par un mécanisme actif d’export dépendant d’une séquence (Nuclear Export Signal, NES) riche en leucines (IQQQLGQLTLENL) localisée à l'extrémité COOH-terminal d’ IkBa. Cette séquence est similaire à celle d’autres protéines qui exercent des fonctions nucléaires (inhibiteur de la kinase dépendante de l’AMPc, VIH Rev, etc). Nos données montrent que l'accumulation dans le noyau de protéines IkBa mutées sans NES fonctionnel retardent le transport de NF-kB vers le cytoplasme. Des expériences menées dans des cellules de mammifère ont confirmé ces propriétés de la séquence NES d’IkBa. Une conséquence fonctionnelle de l’accumulation de protéines IkBa dans le noyau de cellules infectées par le VIH est l’inhibition de l’export des ARN viraux, non épissés ou épissés une fois, dont le transport vers le cytoplasme dépend de la protéine Rev. Comme conséquence de l’accumulation d’ IkBa dans le noyau, la réplication du VIH est fortement inhibée. Le pouvoir inhibiteur d’ IkBa dépend de la présence d’un NES fonctionnel (Bachelerie et al, J. Cell. Science, 1997). La mise en évidence d’un signal actif d’export et du caractère saturable du processus d’export permet d’envisager, par analogie avec l’import nucléaire, l’implication de récepteurs spécifiques pour les protéines contenant un NES. La protéine CRM1 (chromosomal maintenance region 1) essentielle pour la levure nous paraissait être un bon candidat pour jouer un tel rôle sur la base d’homologies de séquences avec l’importine b, de son interaction directe avec des nucléoporines et de sa localisation au niveau du pore nucléaire. Nos résultats montrent que CRM1 s'associe à la région NES de IkBa et que cette interaction est inhibée par un antibiotique (leptomycine B) connu pour bloquer l’activité biologique de CRM1 dans la levure. Un système de reconstitution in vitro de l’export dépendant du signal NES a été utilisé pour montrer que la leptomycine B bloque spécifiquement l’export nucléaire des protéines NES. Ces observations, rapportées simultanément par d’autres groupes, indiquent que CRM1 constitue le récepteur d’export pour les protéines contenant un NES et notamment pour la protéine Rev du VIH puisqu'un blocage de la réplication du VIH est observé dans des cultures de monocytes infectés traitées par la leptomycine B (Ossareh-Nazari et al, Science, 278 : 141-144, 1997). La pertinence biologique de la régulation de l’activation de NF-kB dans les noyaux de cellules de mammifère par la protéine IkBa est suggerée par ces travaux. Nous pensons que le transport rétrograde de complexes NF-kB/IkBa et la dégradation intranucléaire inductible d’IkBa sont deux mécanismes essentiels de la régulation de l’activation de NF-kB dans les noyaux de cellules de mammifère.

f. Domaines régulateurs du LTR du VIH

Notre laboratoire a également montré un rôle insoupconné de la phosphorylation du facteur de transcription Sp-1 dans l’induction NF-kB-indépendante de l’activité transcriptionelle du LTR apres stimulation cellulaire par l’acide okadaique (Vlach et al, 1995), et étudié par résonnance magnetique nucleaire la conformation des sites de liaison à NF-kB et à Sp-I de l’ADN du LTR viral (Delepierre et al, Magnetic Resonance in Chemistry , 34: S67-S80, 1996).

B-. Co-récepteurs et chimiokines inhibitrices de l’entrée du VIH.

Dans la recherche de signaux immunitaires ou de l’inflammation susceptibles d’induire la réplication in vivo du VIH notre attention se porta vers la chimiokine de type CC RANTES qui a la capacité de modifier l’état d’activation de cellules T et de monocytes. Les effets sur le VIH de RANTES (cDNA, protéine de synthèse) furent analysés dans plusieurs systèmes cellulaires. Les résultats obtenus montrèrent clairement l’absence de tout effet transcriptionnel de la chimiokine sur le VIH. La réplication de souches VIH de laboratoire dans des lignées cellulaires transformées n’était pas modifiée par la présence de RANTES. Ces observations et les données publiées par d’autres (Cocchi et al ,Science, 1995) décrivant le blocage sélectif par RANTES de la réplication d’isolats VIH primaires, pouvaient être expliqués, d’après nous, par l’occupation par la chimiokine d’un récepteur nécessaire à l’infection par certains types de virus.

  1. Identification de SDF1 comme étant le ligand naturel du récepteur à sept domaines transmembranaires fusin/LESTR/CXCR4. Description de ses capacités inhibitrices sur l’entrée du VIH-1.

Nous avons démontré que la CXC chimiokine SDF1 (stromal cell derived factor 1) se lie spécifiquement au récepteur LESTR / fusin identifié quelques semaines auparavant comme le co-récepteur de l’entrée de souches VIH dites de laboratoire ou inductrices de syncitia. Nous avons montré que SDF1 est la seule chimiokine ayant cette capacité parmi toutes les chimiokines connues. Nos résultats ont montré que SDF1 induit la mobilisation intracellulaire de Ca++ et l’attraction de cellules mononucléées du sang. Comme conséquence de l’occupation du récepteur, SDF1 empêche sélectivement l’entrée des virus dépendants de LESTR / fusin (nommé dès lors CXCR4 puisque son ligand etait désormais connu) dans les cellules mononucléées du sang. En revanche, ni l’entrée des virus de type R5 (dépendants de CCR5) ni celle des virus pseudotypés avec une protéine d’enveloppe hetérologue (protéine G de VSV) étaient atteintes (Oberlin et al, 1996).

2. Analyse structurale de SDF1.

Nous avons participé au travail qui a permis de résoudre la structure tridimensionnelle de SDF1 (résonance magnétique nucléaire) et établi la corrélation avec ses propriétés biologiques. SDF1 se présente comme un monomère avec un domaine NH2 (aa 1-8) et diffère d’autres chimiokines par la distribution de sa charge et son coeur hydrophobe. Les premiers 8 résidus forment un site de liaison où seul les 2 premiers acides aminés sont impliqués dans la signalisation. La mutation ou modification de ces deux premiers résidus produit des puissants antagonistes. Les résidus 12-17 configurent un autre site de liaison, peut être le site initial d’ancrage, bien défini dans la structure. Seules les molécules ayant une affinité élevée pour le récepteur bloquent l’entrée du VIH dépendante de CXCR4 (Crump et al, 1997).

3. Mécanismes d’action de SDF1 sur l’entrée du VIH.

Nos travaux ont montré que l’occupation de CCR5 par RANTES, et de CXCR4 par SDF1, entraîne l’internalisation rapide de CXCR4 par un mécanisme d’endocytose. Ce phénomène a été observé dans plusieurs types cellulaires et notamment, les lymphocytes T CD4 du sang. Nous avons montré que l’endocytose de CXCR4 dépend de séquences localisées dans le domaine COOH-terminal et cytoplasmique du récepteur. L’endocytose de CXCR4 induite par la chimiokine n’est pas inhibable par la toxine de B. pertussis ce qui indique que les voies de transduction dépendantes de protéines G hétérotrimèriques liées au récepteur CXCR4 ne sont pas impliquées dans l’induction de ce phénomène. La contribution de l’endocytose de CXCR4 au pouvoir inhibiteur du SDF1 sur l’entrée du VIH fut analysée. Utilisant comme cibles de l’infection des cellules CD4+ exprimant des formes de CXCR4 dépourvues du domaine cytoplasmique, nous avons montré que des concentrations anormalement élevées de SDF1 étaient nécessaires pour bloquer l’entrée virale. Les données de ces travaux ont été confirmés depuis par les travaux de quatre autres équipes. Nous avons observé que certaines molécules antagonistes de SDF1 ayant une haute affinité pour le récepteur n’ont pas d’activité antivirale significative. Nos travaux récents nous ont permis d’établir une corrélation entre la capacité de SDF1 à induire l’endocytose et la structure de la protéine. Les déterminants structuraux qui sous-tendent cette fonction ont été définis et nous travaillons à leur caractérisation. Ces résultats renforcent l’hypothèse que l’internalisation des récepteurs CXCR4 est nécessaire pour obtenir l’effet optimal inhibiteur de SDF1.

4. Structure génomique de CXCR4. Identification, isolement et caractérisation fonctionnelle de son promoteur.

CXCR4 est le seul récepteur de SDF1 identifié à ce jour, et d’autres ont montré par knock-out du gène de la chimiokine ou de son recepteur est letal, ce qui suggère qu’il est essentiel pour les actions biologiques très diverses de SDF1 (organogénèse, développement de lymphopoïèse et myélopoïèse embryonaires, attraction de lymphocytes T) de SDF1. Afin de mieux comprendre les mécanismes qui régulent l’expression constitutive et inductible de CXCR4 nous avons entrepris de déterminer la structure génomique de CXCR4 et d’isoler son promoteur. Nous avons utilisé à ce fin une collection génomique de type BAC. Le gène humain de CXCR4 contiens deux éxons séparés par une séquence intronique. Une région de 2.6 Kb en amont du cadre de lecture du gène a été isolée. Dans cette région nous avons identifié une boîte et le site d’initiation de la transcription caractéristiques de promoteurs fonctionnels. Dans cette région se trouvent également de séquences consensus putatives pour des facteurs de transcription parmi lesquels certains impliqués dans l’induction de gènes actifs dans l’hémopoïèse et le développement lymphocytaire. Le promoteur possède une activité constitutive qui se manifeste dans une large diversité de type cellulaires. Les séquences impliquées dans le maintien de cette activité diffèrent selon le type cellulaire. L’analyse de l’activité basale et inductible du promoteur dans les cellules mononucléées du sang montre que le promoteur a une activité constitutive et répond significativement à l’induction par des esters de phorbol associés aux inducteurs de flux calcique. En revanche nous n’avons pas identifié de signaux d’activation physiologiques (récepteur T, cytokines), ou même des lectines, capables d’induire l’activation du promoteur ( Caruz et al, 1998).

5. L’effet inhibiteur de chimiokines sur l’entrée virale est dissociable de leur capacité activatrice

Un obstacle au développement de molécules dérivées de chimiokines actives dans le blocage de l‘entrée du VIH, est l’induction d’effets indésirables liés à leur pouvoir pro-inflammatoire, comme cela est démontré dans des animaux d’experience. Nous avons développé une molécule dérivée de RANTES déletée des 8 premiers acides aminés qui se lie avec haute affinité au récepteur CCR5 mais est dépourvu d’effet biologique détectable. Cette molécule se comporte comme un antagoniste de RANTES et inhibe remarquablement l’entrée du VIH. La liaison de la molécule modifiée au récepteur CCR5, provoque son internalisation. Ces résultats indiquent que des molécules antagonistes de chimiokines pourraient servir de base pour le développement d’agents thérapeutiques capables d’inhiber spécifiquement l’entrée des VIH (Arenzana-Seisdedos et al, 1996). Le type d’inhibiteur décrit est le résultat d’une déletion, et non pas d’addition a posteriori de groupements chimiques. Ceci permet d’envisager leur utilisation par thérapeutique génique, et nous construisons actuellement les vecteurs d’expression appropriés à l’utilisation chez les animaux d’experience.

6. Caractérisation d’un nouveau co-récepteur des VIH et VIS (virus de l’immunodéficience simienne .

Un cDNA codant pour une protéine appartenant à la famille de chimiorécepteurs fût isolé et son expression fût recherché dans une large diversité de types cellulaires. La protéine, appelée TYMSTR est exprimée sur le chromosome 3 dans des lymphocytes T activés mais elle est absente d’autres leucocytes. TYMSTR se comporte comme un co-récepteur pour des souches VIH R5 et X4 ainsi que pour divers isolats permettant la fusion cellulaire et l’infection dépendantes de l’enveloppe virale (Loetscher et al, 1997). TYMSTR est identique aux récepteurs BONZO et STRL33 identifiés independamment par les équipes de D. Litmann et E. Berger, respectivement. Nous avons recherché sans succès le ligand de TYMSTR parmi toutes les chimiokines connues. A ce jour, les fonctions biologiques de TYMSTR restent inconnues de même que sa participation à l’évolution de l’infection naturelle par le VIH.

7. Caractérisation d’un allèle anormal de CCR5 codant pour un protéine sans fonction de co-récepteur pour le VIH.

Nous avons identifié chez un sujet exposé à des risques très élevés de contamination par voie sexuelle, la présence d’un allèle de CCR5 portant une mutation ponctuelle (mutation T en A, position 303 de la séquence nucléotidique) qui introduit un codon stop (codon correspondant à l’acide aminé 101) dans son cadre de lecture. Associé à la délétion D32 de CCR5 présente dans l’autre allèle du sujet analysé, la mutation caractérisée confère une résistance totale à l’infection par les virus de type R5 aux cellules mononucléées du sang in vitro, tandis qu’elles restent susceptibles à l’infection par les virus X4. Le caractère héréditaire de l’anomalie fût établi par une étude familiale (Quillent et al, 1998). La présence de la mutation fait disparaître un site de restriction enzymatique unique (HincII) ce qui permet une recherche aisée d’allèles mutés dans la population générale. La fréquence de la mutation dans une population française sans sélection éthnique est estimée provisoirement à environ 1,5%. Aucun cas d’homozygotisme de la mutation n’a été identifié à ce jour. Dans ce domaine concernant la génétique des populations, nous collaborons avec l’institut Pasteur du Cambodge, dans le cadre d’un travail de thèse que nous dirigons, et montrons que la fréquence dans la population Khmer d’une mutation du promoteur du gène SDF-1 est non seulement détectable, mais même superieure à la fréquence observée chez les Caucasiens (Rousset et al , 1999).

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Goupil Marie-Laure (Goupil@pasteur.fr)

Chercheurs de l'unité

Arenzana-Seisdedos Fernando (farenzan@pasteur.fr) Bachelerie Francoise (fbachel@pasteur.fr) Michelson Susan (michelso@pasteur.fr)
Virelizier Jean-Louis (virelizi@pasteur.fr)

Stagiaires de l'unité

Amara Ali
Valenzuela Agustin
Caruz Antonio
Beissier Patrick
Kroll Mathias
Bodhagi Bahram

Autre personnel de l'unité

Laurent Lysiane
Thomas Dominique
Goupil Marie-Laure

Publications de l'unité

ANNEE 1998

1- QUILLENT C., OBERLIN, E., BRAUN J., ROUSSET, D., GONZALEZ-CANALI G., METAIS P., MONTAGNIER L., VIRELIZIER J-L., ARENZANA-SEISDEDOS F., BERETTA, A. (1998) HIV resistance phenotype conferred by a combination of two separate inherited mutations of the CCR5 gene. The Lancet, 351 : 14-18.

2- ARENZANA-SEISDEDOS, F., AMARA, A., THOMAS, D., VIRELIZIER, J.-L. (1998) ß-chemokine MDC and HIV-1 infection. Science, 281 : 486-487.

3- CARUZ, A., SAMSON, M., ALONSO, J-M., ALCAMI, J., BALEUX, F., PARMENTIER, M., ARENZANA-SEISDEDOS F. (1998) Genomic organization and promoter characterization of Human CXCR4 gene. FEBS Letters , 426, 271-278.

4- BERMEJO, M., MARTIN-SERRANO, J., OBERLIN, E., PEDRAZA, M-A., SERRANO, A., SANTIAGO, B., CARUZ, A., LOETSCHER, P., BAGGIOLINI, M., ARENZANA-SEISDEDOS F., ALCAMI, J. (1998) Activation of peripheral blood T lymphocytes downregulates CXCR4 expression and interferes with propagation of syncitium-inducing HIV strains. Eur.J.Immunol/., 28 : 1-13.

5- BANDRES, J.C., WANG, Q.F., O’LEARY, J., BALEUX, F., AMARA, A., HOXIE, J.A., ZOLLA-PAZNER, S., GORNY, M.K. (1998). HIV-envelope binds to CXCR4 independently of CD4, and binding can be enhanced by interaction with soluble CD4 or by HIV envelope deglycosylation. J. Virol.., 72 : 2500-2504.

6- HEVECKER, N., MONTES, M., GERMEROTH, L., AMARA, A., TRAUTMAN, A., ALIZON, M. and SCHNEIDER-MERGENER, J. (1998) Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides. Current Biology, 8 : 369-376.

7- SCHWARTZ, O., MARECHAL, V., FRIGUET, B., ARENZANA-SEISDEDOS, F., and HEARD J.-M.(1998) Antiviral activity of the proteasome on incoming human immunodeficiency virus type 1. J. Virol., 72, 5 3845-3850.

8- DUMONCEAU, J., NISOLE, S., CHANEL, C., QUIVET, L., AMARA, A., BALEUX, F., BRIAND, P., HAZAN, U. (1998) Spontaneous mutations in the env gene of the Human Immunodeficiency Virus type 1 NDK isolate are associated with a CD4-independent entry phenotype. J. Virol., 72, 512-519.

9- BODAGHI, B., JONES, T.R., ZIPETO, D., VITA, C., SUN, L., LAURENT, L., ARENZANA-SEISDEDOS F., VIRELIZIER, J-L., MICHELSON, S. (1998) Chemokine sequestration by viral chemoreceptors as novel viral escape strategy : withdrawal of chemokines from the environment of cytomegalovirus-infected cells. J. Exp. Med., 188, 855-866.

10- VIRELIZIER, J-L. (1998) Alternative, cytokine-mediated host defense mechanisms against HIV infection: the concept of self-limitation of HIV replication. AIDS, 12: (suppl A)S141-146

ANNEE 1999

1- ZIPETO, D. BODAGHI, B., LAURENT, L., VIRELIZIER, J-L. and MICHELSON S. (1999) Kinetics of transcription of human cytomegalovirus chemokine receptor UD28 in different cell types. J. Gen. Virology, 80 : 543-547.

2- BODAGHI, B., GOUREAU, D., ZIPETO, D, LAURENT, L., VIRELIZIER, J.-L. and MICHELSON, S. (1999) Role of IFN-g-Induced indoleamine 2,3 Dioxygenase and inducible NO-synthase in the replication of human cytomegalovirus in retinal pigment epithelial cells. J. Immunology , 162 : 957-964.

3- ROUSSET,D., REYNES,J.J., FLYE SAINTE-MARIE F, VIRELIZIER J-L (1999) High frequency of the 3’A mutation of the SDF-1 gene in Cambodia. AIDS ,13, 420-421.

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