Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Immunologie moléculaire des parasites

CNRS URA 1960


Responsable : PUIJALON Odile (omp@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Nous étudions les conséquences de l’infection par Plasmodium falciparum chez l’homme ainsi que dans un modèle expérimental chez le singe Saimiri sciureus. Nos efforts de recherche visent à identifier les paramètres qui orientent le système immunitaire vers une réponse protectrice ou pathologique, à mieux comprendre le rôle du polymorphisme parasitaire dans les relations hôte/parasite, et à développer un vaccin en utilisant des molécules conservées reconnues par les effecteurs de la clairance parasitaire. En 1998, nous avons 1) montré que l’anémie grave chez les jeunes enfants impaludés résultait d’un désordre immunopathologique ; 2) analysé l’activation des lymphocytes gd chez l'homme et et chez le singe; 3) mis en évidence l’existence d’une considérable microhétérogénité géographique des populations parasitaires et de fluctuations importantes au cours du temps; 4) étudié les conséquences du polymorphisme allélique sur la réponse immune; 5) amélioré les protocoles de transformation de P.falciparum et procédé aux constructions nécessaires à l’invalidation de deux gènes impliqués dans la virulence et au remplacement allélique d’un troisième; 6) poursuivi l’analyse des potentialités vaccinales de l’antigène conservé R23.

Abstract

The consequences of the infection by Plasmodium falciparum are explored in man as well as in an experimental model, the Saimiri sciureus monkey. Our goals are to identify parameters which orient the immune system towards either a protective or a pathogenic response; to understand the role played by parasite polymorphism in host/parasite relationships; and to develop a vaccine based on conserved molecules recognised by the effectors of parasite clearance. In 1998, we have 1) shown that severe anaemia in young children resulted from a immunopathological disorder; 2) analysed the activation of gd lymphocytes in man and in monkeys; 3) shown the existence of considerable geographical microheterogenity and temporal variation in parasite populations; 4) studied the consequences of allelic polymorphism on the immune response; 5) improved the conditions for P.falciparum transformation and made the constructions needed for the inactivation of two genes involved in virulence and for the allelic replacement of a third; 6) continued the analysis of the potential, as a vaccine, of the conserved antigen R23.

Texte du rapport

La thématique centrale de l’Unité est l’analyse des facteurs qui déterminent l’issue d’une infection palustre, avec comme but de développer un vaccin visant à prévenir la pathologie consécutive à une infection par Plasmodium falciparum. Nos efforts de recherche visent 1) à identifier les paramètres qui orientent le système immunitaire vers une réponse protectrice ou pathologique ; 2) à mieux comprendre le rôle du polymorphisme parasitaire dans les relations hôte/parasite ; 3) à développer un vaccin en utilisant des molécules conservées reconnues par les effecteurs de la clairance parasitaire.

I. Analyse des désordres immunologiques associés à l’infection palustre (Charlotte Behr) L’accès palustre s’accompagne d’une stimulation importante du système immunitaire à l’origine de la production de grandes quantités de cytokines pro-inflammatoires impliquées dans la pathogénèse du paludisme grave. On observe en particulier une activation polyclonale des lymphocytes T et B. Nous avions montré que les lymphocytes T porteurs des chaînes Vg9 et Vd2 du récepteur T sont une des cibles majeures de cette activation ainsi qu’une source importante de cytokines pro-inflammatoires (IFNg, TNFa et TNFb). Nous avons comparé l’activation des lymphocytes T gd et d’autres cellules immunocompétentes dans diverses formes cliniques de paludisme (neuropaludisme, anémie grave et paludisme non compliqué). En collaboration avec des collègues danois et ghanéens, nous avons démontré que l’anémie grave résulte d’un désordre immunopathologique particulier, caractérisé par un rapport TNF-a/IL-10 anormalement élevé. Ces données sont les premières indications que l’anémie grave, une des complications majeures du paludisme chez les jeunes enfants résulterait d’un désordre immunopathologique (Kurtzhals et al, 1998). Nous sommes en train d’analyser 1) l’activation des cellules T gd dans les différents groupes cliniques de paludisme; 2) le degré de clonalité de l’expansion TVg9Vd2 en étudiant par immunoscope la diversité fonctionnelle du CDR3. Les études chez l’homme ne permettant ni d’aborder les événements précoces ni d’étudier la cinétique et la dynamique de l’activation des cellules immunocompétentes dans différents organes, nous avons démarré un programme de recherches sur le modèle expérimental d’infection chez le singe écureuil, Saimiri sciureus, en collaboration avec l’Institut Pasteur de la Guyane. Un grand nombre d’anticorps monoclonaux réagissant avec les sous-populations de leucocytes, avec les cytokines et certains de leurs récepteurs ont été criblés. Grâce à ces outils, nous avons pu analyser la cinétique d’activation des lymphocytes Tgd portant la chaîne Vg9 au cours de l’infection palustre. Des lignées ont été isolées afin de procéder à des transferts passifs à différents moments de l’infection.

II.Analyse de la diversité parasitaire et de ses conséquences biologiques (Odile Puijalon, Serge Bonnefoy, Hélène Jouin, Philippe Dubois, Peter David) L’analyse des populations parasitaires et des caractéristiques des infections chez l’homme dans diverses conditions d’endémie est une étape nécessaire à l’élaboration de stratégies de lutte. Depuis plusieurs années, nous étudions le polymorphisme des populations parasitaires auxquelles sont exposés les sujets dont nous analysons par ailleurs les réponses immunes. Nous cherchons à déterminer dans quelle mesure le polymorphisme parasitaire et la variation antigénique interfèrent avec l’acquisition et/ou le maintien de l’immunité protectrice, et participent à la plus ou moins bonne adaptation biologique des parasites à leur hôte.

  1. diversité parasitaire en zone d’endémie. Le recours à la PCR pour le typage de plusieurs loci polymorphes nous a permis d’analyser la diversité parasitaire dans 2 villages du Sénégal (Dielmo et Ndiop) qui diffèrent par la durée et l’intensité de la transmission et la cinétique d’acquisition de l’immunité. Nous avons observé un polymorphisme allélique important, avec des fréquences alléliques totalement différentes dans les 2 villages, indiquant une micro-hétérogénéité géographique considérable (Konate et al, 1999) Les caractéristiques moléculaires de l’infection sont différentes, en particulier la complexité (nombre moyen de clones parasitaires circulants), faible à Ndiop et importante à Dielmo. Par ailleurs, la complexité diminue chez les habitants de Dielmo à un âge où une immunité efficace se met en place, alors qu'à Ndiop où les adultes restent sensibles au paludisme, la complexité des infections est la même dans toutes les classes d’âge. Ceci indique que ce paramètre de complexité des infections reflète l’immunité anti-parasitaire acquise en zone d’holoendémie (Zwetyenga et al, 1998).
  2. analyse du portage parasitaire au cours de la saison sèche. Pendant la saison sèche, la transmission est interrompue et la survie du parasite dépend en grande partie de sa longévité chez son hôte humain, mais les mécanismes assurant un portage chronique sont encore inconnus. Nous avons réalisé cette année une analyse moléculaire du portage parasitaire chez des habitants de Ndiop pendant la période où la transmission est interrompue et observé qu'en fin de saison sèche, les jeunes enfants n'ont plus de parasites détectables, alors que les enfants plus âgés et les adultes hébergent des parasites. Les populations parasitaires présentes chez les porteurs chroniques en fin de saison sèche sont différentes de celles que les mêmes sujets hébergeaient au début de la saison sèche, indiquant que les parasites subissent une pression de sélection non négligeable pendant le portage de longue durée. L’analyse des parasites circulant lors de la saison de transmission suivante met en évidence des différences importantes dans les fréquences alléliques par rapport à l’année précédente. Ces données montrent donc que les populations parasitaires au sein d’un même village diffèrent d’une saison de transmission à l’autre. La réduction de l’immunité concomitante chez les jeunes enfants ainsi que les changements dans les populations parasitaires au cours de la saison sèche pourraient expliquer le risque élevé qu’ont les jeunes enfants de développer des accès palustres lors de la reprise de la transmission (Zwetyenga et al, 1999).
  3. facteurs de virulence dans le modèle expérimental de l’infection du singe-écureuil. La complexité des paramètres susceptibles d’influer sur l’issue d’une infection chez l’homme est telle que nous avons abordé l’analyse des facteurs parasitaires de virulence dans le modèle expérimental du singe Saimiri sciureus. L’identification des déterminants parasitaires contribuant à la pathologie devrait permettre d’élaborer de nouvelles stratégies d’intervention ciblant spécifiquement les facteurs de virulence parasitaire.

La comparaison du pouvoir infectieux de 14 souches chez le singe Saimiri sciureus a montré que les souches létales possèdent certaines caractéristiques propres. Nous avons commencé un programme de génétique réverse pour étudier la contribution de ces facteurs à la pathologie. La première étape que nous avons réalisée cette année est la mise en place au laboratoire des outils nécessaires aux manipulations génétiques de P. falciparum. Ainsi, avons nous procédé aux constructions nécessaires à l’invalidation de deux gènes et au remplacement allélique d’un autre. Un long travail de mise au point a été nécessaire pour optimiser les conditions de transformation de P. falciparum.

d) Analyse des réponses immunes contre les antigènes polymorphes. Afin d’explorer les conséquences du polymorphisme parasitaire sur les réponses immunes, nous avons analysé les réponses contre les antigènes de la surface du mérozoïte MSP-1 et MSP-2 chez les individus dont nous avons par ailleurs typé les parasites. On observe une spécificité remarquable des réponses contre la région N-terminale polymorphe de MSP-1 (bloc 2), chaque individu ne reconnaissant au mieux que quelques formes alléliques. La spécificité des anticorps n’est pas corrélée avec les allèles MSP-1 des parasites hébergés lors du prélèvement. Un suivi longitudinal indique que la réponse est figée sur quelques formes alléliques (spécifiques pour chaque donneur), suggérant un phénomène de « clonal imprinting ». Nous avons modélisé les réponses immunes à différentes formes alléliques de MSP-2 chez la souris. On observe des réactions croisées partielles avec un hiérarchie intéressante, différentes formes alléliques du même épitope présentant des propriétés immunogéniques différentes.

Nous avons étudié chez l’homme la réponse en anticorps contre l’antigène MSP-1 de Plasmodium vivax, PvMSP-1, plus particulièrement contre la région C-terminale exprimée dans le baculovirus (collaboration avec S. Longacre). Nous avons montré que la quasi-totalité de la réponse en anticorps contre cette partie C-terminale était dirigée contre des épitopes de nature conformationnelle.

Par ailleurs, grâce à une stratégie de criblage différentiel de banque d’expression par des anticorps de singes protégés contre l’un ou l’autre variant antigénique de la souche Palo Alto, nous avons pu identifier avec nos collègues de l’Institut Pasteur de la Guyane, plusieurs cibles nouvelles des réponses spécifiques de variant acquises après une primo-infection. Les réponses spécifiques de variant ne sont pas restreintes au seul antigène variant PfEMP1, mais concernent aussi des antigènes conservés associés à la membrane du globule rouge et dont le taux d’expression diffère dans différents variants antigéniques (Le Scanf et al, 1999). L’étude du pouvoir vaccinant de l’une de ces molécules conservées (PfEMP3) est en cours .

III. Analyse des potentialités vaccinales de l’antigène R23 (Odile Puijalon) Notre stratégie a été d’identifier les antigènes cibles des mécanismes effectuant la clairance des stades sanguins asexués, de ne retenir que les molécules bien conservées entre différentes souches et d’étudier le potentiel vaccinal de ces antigènes chez le singe Saimiri sciureus. Nous avons concentré nos efforts sur l’antigène R23, identifié comme la cible d’anticorps opsonisant les hématies parasitées par P. falciparum. Il provient de la région centrale répétée du gène R45. L’antigène R23 est constitué de onze répétitions de 6 acides aminés dont le motif consensus est Asn His Lys Ser Asp Ser/His/Asn.

Chez le singe Saimiri sciureus, la Glutathion S transférase-R23 (GTR23) seule ou en mélange avec d’autres antigènes recombinants conservés, induit une bonne réponse protectrice, que ce soit chez des animaux pré-immuns , possédant un passé ancien d’infections palustres ou chez les animaux naïfs . Nous avons récemment réalisé une expérience de vaccination dans laquelle nous avons injecté les répétitions R23 sans protéine porteuse en présence d’hydroxyde d’Alumine chez des singes pré-immuns. Nous avons observé une excellente protection contre une infection d’épreuve létale, protection corrélée avec la production d’anticorps de type cytophile. Nous avons cette année procédé à l’immunisation d’animaux naïfs avec l’insertion R23 selon le protocole utilisé précédemment. L’analyse des réponses immunes est en cours.

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