Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Immunogénétique Humaine

INSERM U276


Responsable : FELLOUS Marc (mfellous@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L’unité a développé deux thèmes de recherche en Immunogénétique Humaine et Génétique Humaine. La régulation de l’expression des gènes du CMH II en utilisant des mutants d’expression responsables du syndrome " Bare lymphocyte syndrome ". En collaboration avec l’Institut Pasteur de Tunis nous venons de décrire deux patients appartenant a un nouveau gène de complémentation. L’autre aspect de nos recherches concerne le déterminisme et la différentiation sexuelle. Nous étudions les partenaires du gène SRY (Sex determining region, Y chromosome) qui est le signal primaire déclenchant la formation du testicule. L’autre aspect de cette recherche est d’analyser la cause génétique de le développement et le maintien des cellules germinales en utilisant l'infertilité comme modèle: -3-4% d’hommes présentent des défauts dans la production de sperme, ce qui entraîne leur infertilité. Un faible pourcentage de cas présente des délétions du chromosome Y, mais dans le reste des cas, le défaut génétique est actuellement inconnu. Notre objectif est d’isoler les nouveaux facteurs impliqués dans la détermination/différenciation sexuelle et les gènes impliqués dans le développement et le maintien des cellules germinales. Le travail possède des aspects fondamentaux et des applications dans le domaine de Santé Publique. Les études fondamentales consistent en : - l’identification de facteurs responsables du développement des organes génitaux chez les mammifères - l’identification de facteurs nécessaires pour le développement et le maintien des cellules germinales chez l’homme - l’étude de cancers (l’étude le rôle du chromosome Y dans les cancers du testicule) - l’étude de populations (prédisposition génétique de l’infertilité et des cancers du testicule). Les aspects appliqués dans le domaine de Santé Publique - - les diagnostiques importants - possibilités de nouvelles thérapies (l’infertilité et, bien sur, les contraceptifs).

Abstract

The unit has developed two themes in humain immunogenetics and human genetics. The former consists of the study of the regulation of CMH II genes using expression mutants which are responsible for the bare lymphocyte syndrome. In collaboration with the Institut Pasteur of Tunis, we have identified two patients with a new complementation group. The other aspect of our research is mammalian sex determination and differentiation. We are studying protein partners of the sex determining gene, SRY. Defining a locus at 9p24 associated with a 46,XY female phenotype. The other aspect of this research is the study of the developpment and maintenance of human germ cells, primarily using infertility as a model. Approximately 3-4% of men have defects in sperm production. Approximately 20% of these men have deletions of the Y chromosome, which are responsible for the infertile phenotype. Our objective is to identify new factors involved in sexual development and in germ cell formation. The research has both fundamental and applied aspects for public health. The fundamental aspects consist in the identification of factors responsible for the development of genitalia in mammals, -the identification of factors necessary for the development and maintenance of germ cells - the study of cancer (in particular the role of the Y chromosome in testicular cancer) - population genetics (genetic predisposition for infertility and testicular cancer). Applied studies of interest in public health include - improvements in diagnosis and, - the possibilities of new therapies (for example, infertility).

Texte du rapport

Exposé des thèmes étudiés par les équipes participant au projet

au cours de l’année 1998-1999

Les travaux scientifiques de la formation au cours de l’année 98-99 lui ont permis plusieurs percées dans le domaine de la génétique moléculaire fondamentale et appliquée à la pathologie humaine, principalement dans la régulation des gènes HLA de classe II et sa pathologie et dans la génétique du déterminisme, de la différenciation normale et pathologique des gonades mâles chez l’homme.

Thème 1 : Dr Catherine Alcaïde
Régulation normale et pathologique des gènes du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II dans les macrophages et lymphocytes B humains Introduction

Notre travail porte sur l’étude de la régulation de l’expression des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMH II), qui sont responsables de la présentation antigénique par les macrophages aux lymphocytes auxiliaires CD4+, et constituent par conséquent un élément essentiel au bon déroulement de la réponse immunitaire. Leur expression est régulée de façon spécifique de tissu, le CMH II étant exprimé constitutivement à la surface des lymphocytes B et des cellules dendritiques et pouvant être induit par l’IFNg dans les macrophages. Cette régulation s’exerce principalement au niveau de la transcription des gènes du CMH II, et l’étude de patients provenant de patients atteints d’un déficit de CMH II a permis d’identifier plusieurs facteurs impliqués. Parmi ces facteurs, on trouve les composants du complexe RFX, se liant à un élément conservé dans les promoteurs du CMH II, et CIITA, protéine interagissant avec RFX et déterminant la spécificité de tissu de l’expression des molécules du CMH II.

Anomalies d’expression du CMH II et pathologies

Un premier aspect de notre travail repose sur l’utilisation de deux modèles cellulaires, défectueux dans l’expression du CMH II, correspondant à des cellules de patients atteints d’un syndrome d’immunodéficience sévère (BLS) et à des cellules tumorales humaines et murines. Cette étude consiste principalement à caractériser ces mutants, afin de déterminer en quel point de la voie de signalisation, qui conduit vers l’activation transcriptionnelle des gènes du CMH II, ils sont affectés. En particulier, ce travail nous a menés vers : * La caractérisation d’une lignée de lymphocytes B provenant d’un patient atteint d’une immunodéficience qui résulte de l’absence d’expression des gènes du CMH II. Ces cellules sont phénotypiquement différentes de celles décrites jusqu’ici dans le cadre de cette pathologique, car elles continuent à transcrire certains des gènes du CMH II (DRA, DQA, DMA et DMB). L’analyse du promoteur de DRA dans cette lignée nous a permis de mettre en évidence un nouveau mécanisme de contrôle de la transcription des gènes du CMH II, lequel est indépendant de la présence d’un complexe RFX normal. Ce complexe transcriptionnel avait été décrit jusqu’ici comme indispensable à l’expression des gènes du CMH II. * La caractérisation de la lignée permanente de RAG, cellule issue de macrophage de souris, et négative pour l’expression du CMH II. Nous avons montré que le défaut de RAG est dû à l’absence ou non-fonctionnalité d’un facteur essentiel pour l’expression du CMH II, et différent de CIITA, ainsi que des autres facteurs mutés chez les patients atteints de déficience en CMH II. Nous avons à présent analysé d’autres lignées tumorales murines et humaines, également négatives pour l’expression du CMH II. Notre étude suggère qu’un mécanisme commun est responsable de la non-expression du CMH II dans l’ensemble de cette lignée de macrophages. Nous sommes en train de tester à l’heure actuelle une hypothèse selon laquelle ce mécanisme fait intervenir un facteur inhibiteur de l’activité de CIITA. Les cellules tumorales n’exprimant pas de CMH II pourraient ainsi échapper plus facilement à la surveillance du système immunitaire.

Expression du CMH II et différenciation cellulaire

        Un second aspect de notre travail est l’étude de la régulation de l’expression de CIITA pendant la différentiation cellulaire. Nous avons isolé le gène humain complet de CIITA et étudié les régions régulant sa transcription. Notre travail montre que différents promoteurs contrôlent l’expression de ce gène, l’activité de ces promoteurs étant régulée de façon tissu-spécifique. En effet, nous avons isolé et caractérisé le promoteur de CIITA actif dans les lymphocytes B (promoteur B) et montré l’existence d’un promoteur intragénique de réponse à l’IFNg (promoteur IG/IFN). D’autre part, nous avons exploré les mécanismes moléculaires responsables de l’extinction des gènes du CMH II dans les hybrides résultant de la fusion d’un lymphocyte B CMH II (+) et d’un macrophage CMH II (-). Nos résultats démontrent la présence dans les macrophages d’un facteur répresseur de l’activité du promoteur B de CIITA. Il apparaît, par conséquent, que le phénotype CMH II(-) de ces cellules ne résulte pas de l’absence de facteurs nécessaires à l’expression du CMH II, mais de la présence d’une protéine supprimant la transcription du gène de CIITA.
        Dans l’ensemble, nos résultats apportent des informations complémentaires sur la régulation de la transcription des molécules du CMH II. Notamment, ils montrent que des signaux extra et intracellulaires modulent l’activité du gène et de la protéine de CIITA, contrôlant ainsi l’expression de l’ensemble  des gènes du CMH II, de Ii et des DM pendant la différenciation cellulaire. Par ailleurs, nos données suggèrent que l’activation transcriptionnelle des gènes du CMH II est un phénomène impliquant des complexes transcriptionnels interagissant entre eux, et dont les activités sont par conséquent interdépendantes et indissociables. Il apparaît, par conséquent, qu’il est essentiel de décrypter ces interactions dans le but d’élucider les mécanismes de compensation décrits ci-dessus, et d’améliorer ainsi notre compréhension de la régulation transcriptionnelle de ces gènes.

Thème 2 : Dr Ken McElreavey
Génétique du déterminisme et de la différenciation sexuelle. Développement et maintien des cellules germinales

Introduction

Le déterminisme et la différenciation du sexe s’effectuent grâce à une cascade complexe d’évènements qui nécessitent l’interaction de nombreux gènes. Ches les mammifères, le chromosome Y joue un rôle dominant dans le déterminisme et la fonction du testicule. Le gène SRY (Sex determining Region, Y chromosome) est le signal primaire déclenchant la formation du testicule A l’heure actuelle, les autres étapes de ce mécanisme sont inconnues. Le développement d’un phénotype mâle dépend d’une différenciation normale des gonades et d’une production normale de stéroïdes. L’action de la testostérone va participer à la formation des organes de reproduction internes chez le mâle, et la dihydrotestostérone va contribuer ensuite à la formation des organes génitaux externes mâles. Les anomalies biologiques qui entravent l’action ou la synthèse de la testostérone altèrent le processus de la différenciation du phénotype mâle, et produisent sur le plan clinique un pseudo-hermaphrodisme masculin. Bien que les mutations dans les gènes impliqués dans la synthèse ou la fonction de la testostérone ou ses dérivés soient responsables de la majorité des cas de pseudo-hermaphrodisme mâle, les bases génétiques de l’ambiguïté des organes génitaux externes sont inconnues dans 20% des cas. L’autre aspect de cette recherche est d’analyser la cause génétique de l’infertilité masculine -3-4% d’hommes présentent des défauts dans la production de sperme, ce qui entraîne leur infertilité. Un faible pourcentage de cas présente des délétions du chromosome Y, mais dans le reste des cas, le défaut génétique est actuellement inconnu. Notre objectif est d’isoler les nouveaux gènes impliqués dans la détermination/différenciation sexuelle et les gènes impliqués dans le développement et le maintien des cellules germinales.

Relations entre SRY et les pathologies de la détermination sexuelle humaine

L’identification de la phase ouverte de lecture complète de SRY a permis l’analyse détaillée de ce gène chez des patients atteints des pathologies de la détermination sexuelle suivantes : - dysgénésie gonadique pure 46, XY (phénotype féminin et absence complète de détermination testiculaire), - dysgénésie gonadique partielle 46,XY (phénotype féminin ou ambigü et détermination testiculaire partielle), - Mâles 46, XX et hermaphrodites vrais 46, XX (détermination testiculaire complète ou partielle dans un fond génétique 46, XX). Cette analyse a montré que 20% des femmes XY avec dysgénésie gonadique pure sont porteuses de mutations dans le gène SRY ou présentent une délétion dans la région du chromosome Y qui détermine le sexe. La plupart des hermaphrodites XX et des mâles XX avec ambiguïtés ne portent pas le gène SRY. Le mode de transmission récessif des cas familiaux d’inversion sexuelle XX nous a permis de développer un modèle de détermination sexuelle chez les mammifères : SRY agirait comme un inhibiteur d’un inhibiteur.

Loci autosomiques et anomalies de la détermination du sexe

L’analyse du gène SRY est réalisée systématiquement sur l’ADN de tous les patients. Chez les individus 46,XY, nous recherchons des mutations dans les régions codantes et régulatrices en 5’ et 3’ du gène. Les femmes 46,XY pour lesquelles nous ne détectons pas d’anomalie génétique au niveau de SRY seront également étudiées pour une duplication de la région Xp21-22 par dosage génique et/ou par microsatellites polymorphes. Les patients pour lesquels la recherche de mutation dans les loci en X et en Y s’est avérée normale sont candidats à porter des mutations dans d’autres gènes pouvant être localisés sur les autosomes.

Réversion du sexe XY et chromosome 9p24.1 Nous avons quelque cas de femme XY avec des anomalies de 9p. Les délétions partielles de 9p s’accompagnent généralement de traits typiques tels que la trigonocéphalie, les fentes palpébrales concaves, le cou court et le nez plat. La présence d’organes génitaux anormaux a été constatée chez 70% des individus XY et six cas extrêmes présentant une réversion du sexe ont aussi été rapportés. L'étude des délétions chez les patients présentant une réversion sexuelle a permis de délimiter une région minimale située au niveau de 9p24-pter qui doit contenir un locus impliqué au moins dans le développement testiculaire ("Sex Reversing Autosomal", SRA). Nous avons localisé les points de cassure de deux de ces délétions chez des patients présentant une dysgénésie gonadique à la frontière entre 9p23.3-9p24.1 et nous avons établi un contigu de YACs de la région. Nous avons étudié plusieurs délétions par analyse cytogénétique et moléculaire, ce qui nous a permis de restreindre l’intervalle SRA à 0.5 cM sub-télomérique. Ce travail nous a permis de limiter la région, responsable du syndrome de délétion de 9p de 3 cM, à un peu moins de 300 kb, ce qui permet d'affirmer que la réversion du sexe et le syndrome de la monosomie de 9p sont deux entités différentes.

Déterminisme du testicule, gène WT1 et syndrome de Frasier : Le syndrome de Frasier est caractérisé par un pseudohermaphrodisme masculin et une glomérulopathie progressive. Aucun cas de syndrome de Frasier n'a été reporté comme étant associé à une tumeur de Wilms. Malgré des rapports précédents excluant les gènes WT1 et SRY dans l'étiologie du syndrome de Frasier, nous avons recherché des anomalies du gène WT1 chez des patientes atteintes de ce syndrome. Les 3 patientes étudiées présentent une dysgénésie gonadique pure, une protéinurie chronique ayant abouti à une insuffisance rénale et un caryotype XY. Nous avons mis en évidence chez les 3 patientes des mutations de novo affectant le site d'épissage de l'intron 9. Il existe 2 sites potentiels donneur d'épissage à la fin de l'exon 9 permettant ou non l'introduction de 3 acides aminés supplémentaires (KTS) entre les 2 derniers motifs à doigt de zinc de WT1, codés par les exons 9 et 10. Dans les 3 cas, le même type de mutation a été observé, touchant le site donneur d'épissage. Les mutations affectent uniquement l'épissage de la forme KTS+. Ces expériences démontrent que le syndrome de Frasier, affectant le système urogénital, est dû à des mutations d'épissage du gène WT1 dont résulte une haploinsuffisance de l'isoforme KTS+. Les isoformes de WT1 possèdent des fonctions différentes. Ainsi la présence du motif KTS permet de changer l'espacement entre les motifs de liaison à l'ADN et modifie la spécificité de liaison de WT1 à un site sur l'ADN. Il y a des indications que l'isoforme KTS+ a la capacité de liaison à l'ADN et par contre que l'isoforme KTS- peut être associé aux facteurs d'épissage dans le noyau. Cette observation est peut-être la raison de l'absence de tumeur de Wilms dans des cas de syndrome de Frasier. Nous avons identifié une famille avec deux sœurs qui présentent une protéinurie chronique. Ces deux sœurs portent la même mutation touchant le site donneur d’épissage. Une sœur est 46,XY avec une dysgénésie gonadique pure, mais l’autre est une femme 46,XX avec un ovaire normal. Ceci indique que les isoformes (KTS+/KTS-) du gène WT1 sont nécessaires pour le développement du testicule mais une haploinsuffisance de l’isoforme KTS+ a apparemment aucun effet sur le développement et la fonction de l’ovaire.

Développement et maintien des cellules germinales : Chromosome Y:

Au cours de ces dernières années, différentes régions du chromosome Y ont été délimitées associées à des phénotypes différents : a/ Yp, avec une dysgénésie gonadique 46,XY; b/ La région centromérique de Yq, associée à des anomalies du squelette et de la croissance; c/ Trois loci différents sur la région télomérique de Yq (AZFa, AZFb and AFZc) sont montrés comme associés à une infertilité mâle. Le gène candidat pour AZFc est DAZ (Deleted in Azoospermia). Ce gène code pour une protéine de liaison à l’ARN synthétisée spécifiquement dans les testicules. Nous avons identifié son homologue autosomal de DAZ chez l’homme. Ce gène, DAZL1 (DAZ-like-1), est un gène autosomique qui est le gène ancestral des gènes DAZ présents sur le chromosome Y humain. Après avoir isolé et caractérisé la structure exon/intron de ce gène, nous avons étudié les gènes de la famille DAZ (DAZL1 + DAZ) au cours de l’évolution des primates. Ce travail a permis de montrer que, d’une part, les gènes DAZ ont été transloqués sur le chromosome Y entre 30 et 50 millions d’années et que, d’autre part, sur ce chromosome il y a eu plusieurs évènements indépendants d’amplification du nombre de copies dans les différentes lignées de primates. De plus, en étudiant les exons, nous avons pu montrer qu’il y avait peu de pression de sélection sur les gènes DAZ portés par le chromosome Y suggérant que ces gènes n’avaient qu’une importance limitée dans la spermatogénèse. Enfin, l’observation d’une duplication des gènes DAZ, il y a 55-200 000 ans sur le chromosome Y humain, nous a permis de montrer que la très grande majorité des populations humaines avaient un ancêtre mâle commun récent. Délétions du chromosome Y et l’infertilité masculine Dans la littérature on relève beaucoup de contradictions concernant la fréquence et la position des délétions du chromosome Y chez les hommes infertiles. De plus, la relation phénotype/génotype est très confuse. Nous avons étude du bras long du chromosome Y chez 131 hommes infertiles (idiopathiques et non-idiopathiques). 19 % des hommes avec infertilé idiopathique portent une délétion de chromosome Y. La délétion la plus fréquemment représentée touche la région AZFc mais les régions AZFa et AZFb étaient aussi délétées. Ces délétions ont permis de redéfinir la région AZFb. Mais, il était surprenant l'observer que 7 % des hommes non-idiopathique portaient les délétions du chromosome Y. Cet étude présente un intérêt médical important. L'implication la plus évidente à l'heure actuelle concerne les méthodes d'assistance médicale à la procréation. L'ICSI ("IntraCytoplasmic Sperm Injection") est une technique permettant d'introduire directement dans un ovocyte, un spermatozoïde prélevé dans un éjaculat ou même dans le testicule. Pour les hommes infertiles, la méthode offre la possibilité de procréer et permet de passer outre à nombreux problèmes spermatogéniques. Les anomalies du chromosome Y d'un homme infertile seront ainsi transmises à toute sa descendance masculine.

Une autre partie de notre travail a porté sur l’isolement d’un nouveau gène AHCP (Autosomal Highly Conserved Protein). Ce gène a été trouvé par un criblage de banque d'ADNc de testicules en utilisant une sonde d'origine Y dans la région AZFa. Ce gène est exprimé dans tous les tissus testés (testicule, rate, thymus, prostate, intestin, colon...). Dans le cerveau, le gène est exprimé dans toutes les régions testées: amygdale, noyau caudé, corps calleux... Par contre, aucun transcrit n'a été détecté dans l'ovaire. Nous avons aussi séquencé les ADNc du gène AHCP dans plusieurs espèces de mammifères: souris, rat, chat, porc et boeuf. Cette analyse a montré que la protéine est extrêmement conservée au cours de l'évolution avec une identité supérieure à 99 %. Le gène AHCP est présent chez les oiseaux, les poissons et les insectes. Chez l'homme plusieurs pseudogènes AHCP sont présents dans des régions différentes du génome en particulier dans le complexe MHC de classe II et sur le chromosome Y. Le seul gène transcrit est localisé sur le chromosome 6p23. Enfin, la très forte conservation de la protéine au cours de l'évolution indique potentiellement un rôle important pour la protéine AHCP.

Prédisposition génétique aux l’infertilité

Un type d’hommes infertiles sont des hommes avec un caryotype 46,XX. La majorité des hommes 46,XX porte une portion du chromosome Y sur un de leurs chromosomes X. Environ 30% des hommes 46,XX SRY-positifs a un point chaud de recombinaison entre deux gènes de kinase, l’un sur le chromosome Y (PRKY) et l’autre sur le chromosome X (PRKX). En collaboration, nous avons défini un haplotype du chromosome Y qui prédispose à cette recombinaison illégitime. C’est la première fois qu’un haplotype du chromosome Y est associé à une pathologie humaine.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Edith JOUANIN, Vacataire INSERM

Chercheurs de l'unité

Marc FELLOUS PU
Ken McELREAVEY CRIP
Thomas BOURGERON MCU

Stagiaires de l'unité

Csilla KRAUSZ, Chris OTTOLENGHI, Reiner VEITIA-SARMIENTO, Luis QUINTANA-MURCI, Manoel NUNES, Lara SALAS-CORTES, Stephane JAMAIN

Autre personnel de l'unité

Nicole THERVILLE Techn. INSERM, Brigitte LEMERCIER Techn IP, Helene QUACH, Techn non-perman. IP

Publications de l'unité

99108174
99034590
98386088
98367023
98406122
98384373
98399867
98180880

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