Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Immuno-Hematologie/Immuno-Pathologie


Responsable : Dighiero Guillaume (dighiero@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Le travail de l`Unité d`Immuno-hématologie et Immunopathologie a été consacré à l`étude : I) Des Autoanticorps naturels (AAN) et l`autoimmunité; II) La leucémie lymphoïde chronique (LLC) et la pathologie maligne du lymphocyte B, et III) L`Immunopathologie du SIDA. Dans le domaine des autoanticorps naturels le travail a porté sur la création d`un modèle transgénique de la maladie des agglutinines froides humaines, à l`étude des bases structurales de la polyréactivité des autoanticorps naturels et à l`étude dans un modèle particulier du rôle de l`isotype dans l`affinité des anticorps. Dans le but de mieux définir le rôle du récepteur B pour l`antigène dans le processus de leucémogénèse, nous avons entrepris l`étude de ce récepteur dans 18 familles distinctes de LLC comportant chacune au moins deux membres atteints de la maladie. Dans le domaine du SIDA, nous nous sommes attachés à l`étude de la reconstitution immunologique chez des malades au stade de porteur asymptomatique traités par trithérapie antivirale.

Abstract

Work from the Immuno-hématologie and Immunopathologie Unit has been has been devoted to: I) Natural autoantibodies (NAAB) and autoimmunity; II) Chronic lymphocytic leukemia (CLL) and B cell malignancies and III)Immunopathology of AIDS. As concerns NAAB, our work focused on the creation of a transgenic murine model of human cold agglutinin disease, the structural basis of NAAB polyreactiviy and, in a particular model, the role of isotype in the binding of Ig to antigen. With the aim of better defining the role of the B cell receptor in the process of malignant transformation of B cells we have started the study of of this receptor in 18 different families including at least two members affected with the disease. Finally, we have studied immune reconstitution in previously untreated asymptomatic HIV-infected patients, treated with a classical tritherapy treatment.

Texte du rapport

AUTOANTICORPS NATURELS ET AUTOIMMUNITE

Antécédents

En 1981 avec B. Guilbert et S. Avrameas, nous avons pu démontrer l`existence fréquente dans le sérum humain normal d`autoanticorps naturels polyréactifs. Par la suite, nous avons pu démontrer, que les précurseurs de ces AAN existaient avec une fréquence très importante dans le répertoire B normal (1983) et qu`ils étaient présents très tôt pendant l`ontogénie (1985). Cette notion a été définitivement établie par nous (1986) et d`autres groupes en démontrant que ces anticorps sont une composante très importante du répertoire germinal, puisqu`ils apparaissent tôt dans l`ontogénie, expriment des idiotopes récurrents et des gènes en configuration germinale.

Ces travaux montrent clairement que l`autoimmunisation est un phénomène physiologique. Si ces autoanticorps sont toujours dirigés contre des composants du soi, ce qui autorise à les appeler autoanticorps, ils ne sont toutefois pas spécifiques de l`individu, puisqu`ils reconnaissent des déterminants publics, présents chez tous les individus d`une même espèce, et parfois comme c`est le cas des autoanticorps anti-ADN et anti-récepteur de l`acéthylcholine, communs à des espèces différentes. Cette dernière caractéristique est par ailleurs partagée par les autoanticorps pathologiques.

Le deuxième élément nouveau fut la démonstration que ces autoanticorps naturels sont capables de reconnaître à la fois plusieurs antigènes aussi éloignés que le DNA, les protéines du cytosquelette et des antigènes phospholipidiques (1983 et 1988). Cette notion, qui a été très controversée lors de notre description initiale (1982 et 1983) est à présent établie. Le mécanisme par lequel ces anticorps sont capables de réagir simultanément avec des antigènes très différents reste cependant à établir.

Si le rôle physiologique de ces AAN reste à définir, il est très probable que ces AAN constituent une composante essentielle de l`immunité naturelle et qu`ils jouent un rôle majeur comme première barrière de défense. Reste à définir si ce répertoire, pourrait constituer un répertoire précurseur des anticorps immuns et des autoanticorps pathologiques.

Pendant cette année, nos travaux sur ce sujet ont été consacrés à : 1) La création d`un modèle de souris transgénique d`anémie hémolytique autoimmune; 2) Mieux définir les corrélations entre la structure et l`affinité des AAN polyréactifs; 3) Etudier dans un cas précis, la capacité de la partie CH1 de 2 anticorps de moduler les interactions antigène-anticorps.

Projets de recherche

  1. Création d`un modèle de souris transgénique d`anémie hémolytique autoimmune. (Christine Pourcel, cpourcel@pasteur.fr)

La maladie des agglutinines froides (AF), est caractérisée par la production d`autoanticorps froids dirigés contre des déterminants glycolipidiques du globule rouge, qui donnent lieu à une anémie hémolytique autoimmune (AHAI). Nous avons étudié au niveau moléculaire une agglutinine froide (CAGAS) qui avait la particularité d`agglutiner les globules rouges de souris avec une meilleure affinité que les globules rouges humains et de les hémolyser en présence de complément, ce qui fait d`elle un candidat de choix pour créer un modèle expérimental murin. Après avoir introduit dans des vecteurs d`expression eucaryotes les fragments d`ADN contenant tous les éléments nécessaires à l`expression de CAGAS, ils ont été transfectés par électroporation dans le myélome de souris non-sécrétant X-63 et les clones exprimant CAGAS ont été sélectionnés. Deux groupes de souris normales BALB/c ont été injectées soit avec l`IgMGAS soit avec des cellules transfectées par voie intra-péritonéale. Les deux groupes ont développé une maladie des AF. Ces résultats montrent pour la première fois la possibilité de créer un modèle murin de la maladie des AF humaine. Des souris transgéniques exprimant la chaîne lourde, la chaîne légère et les deux chaînes de l`AF ont été obtenues. L`expression exclusive de la chaîne lourde humaine résulte en un blocage au stade pro-B, qui est probablement la conséquence d`une association inadéquate entre la chaîne lourde humaine et lambda 5 de la souris. Un défaut du mécanisme d`exclusion allélique a été aussi observé chez ces souris. Chez les souris double-transgéniques la coexpression simultanée des chaînes lourdes et légères humaines a permis de contourner le blocage pro-B. Toutefois, à cause de mécanisme de tolérance, soit les nombreuses cellules B médullaires exprimant le transgène complet ont été éliminées au niveau de la moelle osseuse, soit leur récepteur a été édité. Quelques cellules B ont échappé à ces mécanismes de tolérance et ont réussi à sécréter l`AF à des faibles taux qui se sont révélés être insuffisants pour induire la maladie. Des études sont en cours pour essayer de contourner la sélection négative du transgène opérée par la souris. Mis à part la création du premier modèle animal de cette maladie, ces souris constituent le premier modèle d`étude de la tolérance aux glycolipides et pourraient constituer un modèle privilégié pour l`étude des vaccins anti-idiotypiques.

2) Corrélations entre la structure et l`affinité des AAN polyréactifs. (Guillaume Dighiero, dighiero@pasteur.fr)

Les autoanticorps naturels (AAN) sont capables de reconnaître à la fois plusieurs antigènes aussi éloignés que l`ADN, les protéines du cytosquelette et des antigènes phospholipidiques, mais les bases structurales de cette polyréactivité restent à définir. En utilisant le BIAcore, nous avons montré que certains de ces anticorps polyréactifs reconnaissent différents antigènes à la fois avec des affinités allant de 10-6 à 10-8, qui correspondent à des affinités fréquemment retrouvées dans les anticorps immuns. Les études structurelles menées en parallèle n`ont pas permis de retrouver des corrélats structurels à cette polyréactivité. Toutefois, des études cristallographiques récentes, montrent l`absence de corrélats structurels qui puissent expliquer la réactivité croisée de certains anticorps contre différents antigènes. L`adaptabilité moléculaire de surface qui est un principe général à la base de la promiscuité des interactions protéine-protéine pourrait jouer un rôle important dans la polyréactivité des anticorps naturels.

3) Etude dans un cas précis, de la capacité de la partie CH1 de 2 anticorps de moduler les interactions antigène-anticorps. (Guillaume Dighiero, Otto Pritsch)

Bien que le processus de commutation isotypique s`accompagne fréquemment d`une maturation dans l`affinité de l`anticorps, celle-ci est essentiellement le produit de mutations somatiques intervenant dans les parties hypervariables et il est généralement admis que les parties constantes des chaînes lourdes ne jouent pas un rôle dans le déterminisme de l`affinité d`un anticorps. Nous avons étudié au niveau moléculaire 2 protéines monoclonales (IgA1 et IgG1) exprimant une activité autoanticorps anti-tubuline, présentes dans le sérum d`un malade atteint d`une gammapathie monoclonale multiple. La séquence protidique complète des chaînes lourdes et légères de l`IgA1 et de l`IgG1 était identique au niveau des domaines variables. A partir du cDNA des lymphocytes B du malade la séquence nucléotidique de l`IgA a été établie, et à partir des lymphocytes T du même malade ses contreparties germinales non réarrangées ont été obtenues. L`affinité pour la tubuline de l`IgA1 et de l`IgG1, déterminée par BIAcore et par ELISA, a montré une différence très significative de l`ordre de 30 fois (2,85 x 10-8 M pour l`IgA1 et 1,02 x 10-6 M pour l`IgG1). Des résultats comparables ont été trouvés en déterminant l`affinité avec des fragments F(ab`)2 et Fab. Cette différence dans l`affinité de ces deux Ig était donnée par une différence très importante dans la constante cinétique d`association.

Comme la seule différence de structure primaire entre le Fab de l`IgA1 et celui des IgG se trouve au niveau du CH1 de la chaîne lourde, ces résultats obligent à admettre la possibilité que les différences au niveau du CH1 sont capables dans ce modèle, d`induire une différence significative dans la structuration du site de liaison avec l`antigène. Ces études viennent d`être confirmées à travers la définition de l`épitope reconnu dans la tubuline et la production d`Ig recombinantes comportant la partie VH et VL de l`IgA associée à des isotypes différents (mu et gamma1). Des études de microcalorimétrie et de cristallisation sont en cours.

LA LEUCEMIE LYMPHOIDE CHRONIQUE (LLC) ET LA PATHOLOGIE MALIGNE DU LYMPHOCYTE B

Antécédents

  1. Etudes pronostiques et thérapeutiques dans la LLC.

Avec Jacques-Louis Binet, nous avons décrit une classification pronostique de cette maladie qui a permis de séparer les malades en trois groupes pronostiques et qui a été adoptée comme la classification internationale de référence. Depuis 1976, avec Jacques-Louis Binet, Claude Chastang et Philippe Travade, nous avons constitué le Groupe Français Coopératif pour l`étude de la Leucémie Lymphoïde Chronique. Ce groupe comprend plus de 80 services français et a réussi à inclure plus de 3000 malades dans des protocoles thérapeutiques. L`étude de trois protocoles randomisés nous a permis de montrer que : 1) Les malades appartenant au groupe de bon pronostic ne devraient pas recevoir de traitement dans un premier abord, puisque ces malades ont une survie proche de celle d`une population normale du même sexe et du même âge. Fait important, ce groupe comprend deux tiers des malades atteints par cette maladie. 2) Dans les formes graves de la maladie, nous avons démontré l`intérêt d`une association polychimiothérapique (CHOP) et d`un analogue des purines, la Fludarabine.

2) Etudes biologiques

  1. Le lymphocyte B qui prolifère dans la LLC exprime d`une façon caractéristique de faibles taux d`immunoglobulines de membrane.

Depuis 1972, nous nous intéressons à la biologie du lymphocyte B qui prolifère dans la LLC. Nous avons montré que le lymphocyte B de la LLC, exprime une quantité très faible d`immunoglobulines de membrane (1974, 1976, 1980). Cette anomalie, qui associée à des défauts fonctionnels de ce lymphocyte ont conduit à postuler que le lymphocyte B qui prolifère dans cette maladie est une cellule B ³ anergique ², est encore de nos jours considérée comme le meilleur marqueur diagnostic de cette maladie.

b) La pathologie maligne du lymphocyte B implique fréquemment le répertoire producteur des AAN.

Dans trois modèles différents (LLC, lymphomes folliculaires et protéines monoclonales) nous avons pu démontrer que le répertoire qui produit les AAN, est fréquemment la cible des processus de transformation maligne du lymphocyte B. Comme ce répertoire, du fait de son autoréactivité est constamment sollicité, nous avons postulé que cet état d`activation permanente, pourrait créer les conditions propices à la survenue d`un événement oncogénique.

En collaboration avec Michel Potter du NIH, nous avons étudié l`activité anticorps de 33 myélomes induits par l`injection intra-péritonéale de silicone. Neuf parmi ces 33 myélomes présentaient une activité AAN. Cette fréquence est proche de celle que nous avions retrouvée dans les protéines monoclonales humaines. De plus, sur 6 clones indépendants que nous avons étudié sur le plan structural, 4 partageaient le même réarrangement et la même séquence VH et VL. Ces résultats indiquent que ces myélomes dérivent fréquemment d`un précurseur B spécifique, engagé dans la production d`une activité AAN et qui exprime une gamme restreinte de gènes VH. De plus, nous avons pu montrer l`existence parmi ces myélomes de réarrangements secondaires au niveau des chaînes.

c) Etude de l`expression des gènes VH dans la pathologie maligne du lymphocyte B.

Nous avons entrepris d`étudier l`expression des gènes V dans la pathologie maligne du lymphocyte B. Nous avons étudié cette expression surtout dans les hémopathies lymphoïdes chroniques (LLC, Leucémie Prolymphocytaire et Leucémie à Tricholeucocytes). De ces études, il ressort que l`expression des gènes VH ne se fait pas en suivant un processus aléatoire et qu`il existe un certain nombre de gènes surexprimés lors des différentes pathologies malignes du lymphocyte B. Les raisons de la surexpression de certains gènes ne sont pas connues à ce jour.

Projets de recherche

Etude dans des cas familiaux de LLC du rôle du récepteur de l`antigène dans le processus de leucémogénèse. (Béatrice Brogard, bbrogard@pasteur.fr)

Dans la LLC, le récepteur B est caractérisé par la très faible expression des Ig de membrane (Igm) et de la chaîne Igb (CD79b). Le BCR est composé d`Igm complexée avec deux hétérodimères covalents Iga/Igb. Pendant les dernières années, de nombreuses études ont été consacrées à l`étude des gènes codant pour les Ig et les chaînes Iga/Igb. Des travaux récents ont montré chez un grand nombre de malades atteints de LLC une absence d`expression de la chaîne Igb à la surface des lymphocytes B et que cette faible expression pouvait être la conséquence de plusieurs mutations principalement situées dans les domaines trans-membranaires et cytoplasmiques. Nous avons alors recherché si une telle anomalie de la molécule CD79b présentait un caractère génétique (présence des mêmes altérations structurales à l`intérieur d`une famille donnée) ou épigénétiques (altérations structurales différentes à l`intérieur d`une famille donnée). Ce travail a permis d`analyser l`ADN de 20 malades atteints de LLC provenant de 10 familles différentes (familles italiennes 1 à 8 étudiées précédemment pour l`expression des gènes VH des Ig, plus 2 familles : 13 et 14). Les résultats de séquençage de l`ADN génomique ont montré quelques mutations de la molécule CD79b au niveau des domaines extra-cellulaire, transmembranaire ou intracytoplasmique mais aucune délétion ou insertion pouvant induire une anomalie structurale de la protéine De plus aucune mutation identique n`était retrouvée parmi les deux individus appartenant à une même famille ce qui excluait un caractère génétique à une anomalie de la chaîne CD79b dans la LLC. Notre travail s`oriente maintenant à déterminer s`il existe une anomalie au niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel. Au niveau transcriptionnel, il se pourrait qu`il existe une présence, en quantité anormale, de transcrits courts provenant d`un épissage alternatif et ne possédant pas le domaine extra-cellulaire. L`absence du domaine extracellulaire de la molécule pourrait entraîner une diminution d`expression du récepteur B pouvant alors exercer un rôle de régulation négative dans l`activation des cellules B. Au niveau post-transcriptionnel, nous étudions en ce moment : 1) la biosynthèse des chaînes IgM, CD79a et CD79b ; 2) l`association de l`hétérodimère CD79a/CD79b avec la molécule d`IgM ; 3) le repliement de ces molécules dans le réticulum endoplasmique et 4) le transport de ce complexe du réticulum endoplasmique vers le Golgi. Nous nous proposons d`étudier ces différents aspects de la biosynthèse et du transport du récepteur B dans la LLC par comparaison avec ceux de lymphocytes B normaux.

IMMUNOPATHOLOGIE DU SIDA

Antécédents

La perte sélective des lymphocytes CD4 est le fait marquant de l`infection par le VIH. Bien que la déplétion de la population CD4 soit le mécanisme principal par lequel le virus induit le syndrome d`immunodéficience, de nombreuses anomalies fonctionnelles ont été rapportées dans les cellules CD4, CD8, NK, cellules B et les monocytes/macrophages. Depuis 1988, nous nous sommes intéressés à l`étude des sous-populations CD4, CD8 et NK, pendant l`infection par le virus VIH. Ces études ont réussi à établir l`existence d`une anergie fonctionnelle des sous-populations cellulaires CD4, CD8 et NK, déjà présente aux stades initiaux de la maladie, à un moment où les cellules CD4 n`accusent pas une diminution marquée (1992,1992,1996).

Nos travaux ont permis de montrer pour la première fois, que le défaut prolifératif observée dans les cellules CD4 est directement corrélé à un déficit dans le processus de phosphorylation des tyrosines, à une expression diminuée de la tyrosine-kinase p56lck et à une expression augmentée de la p59fyn. Cet aspect biochimique est très proche de celui retrouvé dans des clones murins anergiques, où l`on observe la triade déficit de phosphorylation, sous-expression de p56lck et surexpression de p59fyn (1994). Nous avons aussi pu prouver que le stress oxydatif chronique jouait un rôle majeur dans l`altération très profonde de la réponse proliférative observée dans les lymphocytes CD4 des sujets infectés par le VIH et qu`un traitement anti-oxydant était capable de rétablir une réponse proliférative très perturbée et la fonction phosphatase de la molécule CD45 (1996).

Pour évaluer le rôle potentiel des superantigènes, dans le défaut fonctionnel des effecteurs du système immun, nous avons étudié la réponse des lymphocytes circulants des sujets infectés par le VIH, à la nucléocapside rabique. Nous avons pu montrer que la stimulation préalable par ce superantigène induisait un processus d`anergie fonctionnelle des lymphocytes périphériques, consécutive à l`augmentation considérable dans la sécrétion d`IL-4 et IL-10 (commutation Th1-Th2) (1994).

Projet de recherche

Etude de la reconstitution immunologique des malades infectés par le virus VIH après trithérapie. (Daniel Scott-Algara, scott@pasteur.fr)

Un progrès majeur sur le plan thérapeutique a été accompli dans le SIDA, à travers l`utilisation des anti-protéases et leur association à des inhibiteurs de la transcriptase inverse. Ces nouveaux traitements ont réussi à améliorer la survie des malades et à induire une augmentation significative des nombres des lymphocytes CD4. Toutefois, il n`est pas encore établi si ces traitements sont capables d`induire une reconstitution complète du système immun. Ce problème a été abordé par notre laboratoire, qui a étudié la reconstitution immunologique dans le cadre d`un essai promu par l`ANRS (protocole 072 TRILEGE). Dans cette étude des malades non-préalablement traités recevaient initialement une trithérapie classique (Zidovudine, 3TC et Indinavir), et après 12 semaines de traitement étaient randomisés sur trois thérapeutiques d`entretien. Dans le cadre de cette étude, une sous-population représentative de l`ensemble de 72 patients, a été extensivement étudiée sur le plan de la reconstitution immunologique pendant 60 semaines. Les sous-populations CD4 et CD8 ont été quantifiées par immunofluorescence. Les cellules naïves ont été définies par l`expression simultanée de CD45RA et CD62L et les cellules activées à travers l`expression de CD38 et ou DR. Les valeurs au début du traitement ont été : CD4 363/µl (272-425), CD8 759/µl (616-944) et les valeurs de la charge virale plasmatique de 4,46 log +/- 0,39 (ARN VIH-1). Cette étude a montré clairement que les cellules CD4 et CD8 naïves augmentaient très précocement après l`institution de la trithérapie et que cette augmentation persistait dans le temps. Les cellules CD4 et CD8 naïves correspondaient à la moitié de l`augmentation de ces deux sous-populations lymphocytaires. Un résultat surprenant de cette étude a été l`absence de modification dans l`expression des marqueurs d`activation. En conclusion, une augmentation rapide et soutenue des cellules naïves a été observée ; ce qui serait en faveur d`un renouveau important des cellules du système immun et d`une absence d`affectation des cellules souches chez ces malades étudiés à un stade précoce de la maladie.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

BOUYSSIÉ Reine, IP, bouyssie@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

BROGARD Béatrice, Chargé de Recherche au CNRS, bbrogard@pasteur.fr LEVY Martine, IP, Chargé de Recherche IP, mlevy@pasteur.fr POURCEL Christine, Chef de Laboratoire IP, cpourcel@pasteur.fr SCOTT-ALGARA Daniel, Chargé de Recherche IP, scott@psteur.fr

Stagiaires de l'unité

ALFONZO DIAZ Miguel, malfon@pasteur.fr HAVOUIS Séverine, Thèse, shavouis@pasteur.fr MALOUM Karim, Post-doc

Autre personnel de l'unité

DUMAS Gérard, Technicien Supérieur IP, dumas@pasteur.fr JOUANNE Colette, Ingénieur d`Etudes au CNRS MAGNAC Christian, Ingénieur IP, magnac@pasteur.fr VUILLIER Françoise, Ingénieur IP, vuillier@pasteur.fr

Publications de l'unité

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