Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Interactions Bacteries-Cellules


Responsable : COSSART Pascale Pascale (pcossart@pasteur.fr) (pcossart@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Notre unité étudie les bases moléculaires et cellulaires de l infection par Listeria monocytogenes, une bactérie modèle pour l étude des interactions hôtes-pathogènes. L. monocytogenes est une bactérie responsable d infections alimentaires graves (septicémies, méningites, méningo-encéphalites et avortements) chez l homme et les animaux. Elle a la capacité de traverser 3 barrières physiologiques importantes: la barrière intestinale, la barrière foeto-placentaire et la barrière hémato-méningée. In vitro, L. monocytogenes est capable d entrer dans de nombreux types cellulaires et de s y multiplier. Après lyse de la vacuole de phagocytose, L.
monocytogenes peut se mouvoir à l intérieur du cytoplasme grâce à une polymérisation continue d actine cellulaire et former des protrusions au niveau de la membrane plasmique lui permettant d envahir les cellules adjacentes sans entrer en contact avec le milieu extérieur. Par une approche associant des techniques de génétique bactérienne et de biologie cellulaire, nous cherchons à déterminer les bases du pouvoir pathogène de cette bactérie. Les résultats obtenus in vitro sont ensuite testés dans des modèles animaux

Abstract

Our unit is working on Listeria monocytogenes, an invasive, intracellular facultative bacterium which we use as a model to study intracellular parasitism. This pathogenic bacterium is responsible for meningitis, meningoencephalitis, septicemias, abortions in humans and animals. L. monocytogenes is able to invade many cultured cell lines, to replicate and to move intra or intercellularly by an actin polymerization mechanism. We are focusing on the molecular and cellular mechanisms of Listeria entry into cells, intracellular movement and cell to cell spread. The in vivo relevance of these in vitro studies is also evaluated.

Texte du rapport

I. L ENTREE DE L. MONOCYTOGENES
DANS LES CELLULES DE MAMMIFERES

(H. Bierne, L. Braun, S. Dramsi , R. Jonquières et M. Lecuit)

1.L internaline et son récepteur : la

E-cadhérine.

L internaline est une protéine de surface de 800 acides aminés, nécessaire à l entrée dans les cellules entérocytaires humaines de la lignée Caco-2. Son récepteur cellulaire est la E-cadhérine. C est la première fois que l on montre que cette molécule d adhésion peut être utilisé comme récepteur par un pathogène. Nous avons récemment délimité la région de l internaline impliquée dans l interaction avec les cellules. C est la région amino-terminale composée de répétitions riches en résidus leucine (ou LRRs). Nous étudions actuellement les régions de la E-cadhérine nécessaires et suffisantes pour l internalisation ainsi que les voies de signalisation impliquées au cours de l entrée
internaline-E-cadhérine. L analyse de différentes souches de L. monocytogenes d'origine variées (souches cliniques ou d origine alimentaire) a montré que l internaline n est pas toujours exprimée à la surface des bactéries et peut être sécrétée sous une forme tronquée dans le surnageant de culture en raison d une mutation dans le gène inlA.

2. La protéine InlB, son récepteur et la signalisation menant à l entrée

InlB est une protéine de 630 acides aminés, similaire à l internaline. Elle permet l entrée de L. monocytogenes dans les hépatocytes et dans de nombreuses cellules épithéliales, endothéliales et dans certains fibroblastes. Cette protéine est associée de façon non covalente à la surface des bactéries par un nouveau type d attachement qui fait intervenir une région répétée en C-terminale organisée en modules GW. Nous avons montré qu InlB est suffisante pour induire l entrée de L. monocytogenes dans les cellules en culture. Son récepteur cellulaire est en cours d identification. Nous avons montré que les 176 premiers acides aminés (région LRR) de cette protéine étaient nécessaires et suffisants pour l entrée InlB-dépendante. Les événements moléculaires qui se produisent dans la cellule hôte en aval de l interaction entre InlB et la cellule commencent à être élucidés. Nous avons montré qu une lipide kinase cellulaire, la phosphoinositide (PI) 3-kinase, est nécessaire à l entrée de L. monocytogenes. Nous avons montré que l activation de cette enzyme requiert la protéine InlB et la présence des protéines cellulaires phosphorylées en tyrosine, Gab-1, Cbl et Shc. La protéine tyrosine kinase qui phosphoryle ces protéines adaptrices n a pas été encore identifiée. Nous avons récemment montré que la protéine InlB purifiée est capable d activer la PI 3-kinase. C est le premier agoniste bactérien de cette lipide kinase.

3. L entrée dans les cellules neuronales.

Afin de comprendre les mécanismes de
franchissement de la barrière hémato-encéphalique, nous avons analysé l entrée de L. monocytogenes dans des cellules primaires d origine gliale et neuronale. Nous avons montré que l invasion des cellules gliales ne requiert pas de gènes spécifiques de L. monocytogenes. En revanche, l entrée de L. monocytogenes dans les cellules neuronales est un événement rare dont l efficacité est augmentée par passage de cellule à cellule à partir de macrophages infectés.

II- IDENTIFICATION DES MOLECULES
SPECIFIQUES DES PHAGOSOMES
CONTENANT L. MONOCYTOGENES (J.
Pizarro-Cerda)

Ce projet sera initié en isolant par fractionnement subcellulaire des phagosomes contenant soit L. monocytogenes, soit L. innocua, une espèce proche non-pathogène et non-invasive, soit des billes de latex couplés aux protéines d invasion de Listeria, InlA ou InlB. Les phagosomes seront isolés à des temps variables après incubation avec les bactéries ou les billes dans différents types de cellules. La composition de ces phagosomes (protéines et lipides) sera analysée sur des gels en 2D et l identification des protéines sera réalisée à l aide de la spectrométrie de masse. Le but de ce projet est d identifier les molécules participant aux événements précoces de l infection.

III. MOUVEMENTS INTRACELLULAIRES
ET POLYMERISATION DE L ACTINE (V.
David, P. Dehoux, E. Gouin, et V. Villiers)

La polymérisation de l actine à la surface de L. monocytogenes, phénomène indispensable aux mouvements intracellulaires de la bactérie, nécessite des facteurs bactériens et cellulaires. Le seul facteur bactérien essentiel est la protéine de surface ActA qui recrute des facteurs cellulaires et favorise l?assemblage de l?actine. Nous avons montré que le domaine amino-terminal d ActA est suffisant à l assemblage de l actine et à la motilité intracellulaire. Nous analysons de façon systématique cette région par une approche génétique et par biochimique afin d identifier les sous-domaines essentiels à la fonction d ActA. L utilisation du système double hybride chez la levure ainsi que des expériences de "cross-linking" ont montré qu ActA est un dimère à la surface de la bactérie. Les ligands intracellulaires d'ActA sont en cours d identification. Une approche par affinité a permis d identifier la cofiline ainsi que d autres protéines dont le rôle au cours du processus de polymérisation est étudié. Certaines rickettsies utilisent comme Listeria la polymérisation de l actine pour se propulser dans les cellules et envahir les cellules voisines. Nous avons comparé ce phénomène à celui de Listeria et Shigella par des études en microscopie à fluorescence et en microscopie électronique. Nos résultats indiquent que les ricketssies utilisent un système de motilité différent de celui de Listeria et Shigella.

IV. LA REGULATION DE L EXPRESSION
DES GENES DE VIRULENCE (S. Dramsi et
A. Renzoni)

Nous avons montré que la protéine PrfA est un activateur pléiotrope de la transcription de la majorité des gènes de virulence de L. monocytogenes. L expression de cette protéine est complexe. Nous avons montré que dans certaines conditions environnementales où les gènes de virulence sont réprimés, la protéine peut être présente mais inactive. Plus récemment, nous avons montré que l expression de la protéine PrfA est augmentée en présence des cellules hôtes. Nous recherchons actuellement le(s) signal(aux) cellulaire(s) responsable(s) de cette induction.

V. IDENTIFICATION IN VIVO DE
NOUVEAUX GENES DE VIRULENCE DE
L. MONOCYTOGENES (H. Fsihi)

Le but de ce projet est d identifier et de caractériser les gènes de L. monocytogenes indispensables à sa survie et à sa prolifération in vivo dans un modèle expérimental murin. Pour cela, une approche génétique de mutagénèse par transposon ou "Signature-Tagged Mutagenesis" (STM) a été choisie. Nous avons construit une banque de mutants L. monocytogenes étiquetés à l'aide de 96 transposons différents et les premiers criblages chez la souris sont en cours de réalisation. Par une sélection négative des mutants présents dans l inoculum initial qui ont été incapables de survivre dans l animal, les gènes requis pour la virulence in vivo sont identifiés. L utilisation de plusieurs lots de mutants étiquetés nous permet un criblage simultané d un grand nombre de mutants dans un nombre réduit d animaux.

VI. SEQUENCAGE DU GENOME DE L.
MONOCYTOGENES ET L. INNOCUA (P.
Dehoux et H. Fsihi)

En collaboration avec le laboratoire de génomique des pathogènes, le séquençage du génome de Li. monocytogenes a été entrepris. Nous séquençons également le génome de la bactérie non-pathogène L. innocua afin de pouvoir identifier par, comparaison de nouveaux gènes de virulence.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

MATUSZEWSKI Marie-Hélène

Chercheurs de l'unité

DAVID Violaine, CR2 INSERM
DRAMSI Shaynoor, Assistante IP
FSIHI Hafida, Assistante IP

Stagiaires de l'unité

BIERNE Hélène, CR1 INRA
BRAUN Laurence, Post-doc ARC
DUPUY Catherine, D.E.A.
JONQUIERES Renaud, Thèse
LECUIT Marc, Thèse
PETTERSON Elaine, Stagiaire
PIZARRO-CERDA Javier, Post-Doc ARC
RENZONI Adriana, Thèse

Autre personnel de l'unité

DEHOUX Pierre, IP
GOUIN Edith, IP
VILLIERS Véronique, IP

Publications de l'unité

97193688
97230331
97270455
97277005
97277210
97298121
97426036
97439812
98053878
98053980
98105103
98194719
98222666
98269825
98298068
98336171
98380398
98382985
98393514
98402550
99085670
99098349
99108930

Ireton K. and Cossart P.(1997) Mécanismes d entrée de Listeria monocytogenes dans les cellules de mammifères : facteurs bactériens, ligands cellulaires, signalisation. Annales de l Institut Pasteur, 8 : 131-138.

Lasa I., Egile C., Cossart P. and Sansonetti P. (1997) Motilité intracellulaire et polymérisation de l actine par Listeria monocytogenes et Shigella flexneri. Annales de l Institut Pasteur, 8 : 163-172.

Cossart P. Michel E. and Sheehan B.(1997) Listeria monocytogenes In Bacterial Genomes. Ed. by F. J. de Bruijn, J. R. Lupski and G. M. Weinstock, pp. 679-680.

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