Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Unité de génétique des interactions macromoléculaires

CNRS URA 1300


Responsable : Alain Jacquier (jacquier@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Nous étudions divers aspects du devenir des ARN. Le métabolisme des ARN pré-messagers et en particulier les mécanismes qui permettent l'épissage des introns sont le point central de nos recherches. L'organisme modèle sur lequel nous travaillons est la levure Saccharomyces cerevisiae. Le criblage génomique double-hybride que nous effectuons permet d'établir un réseau protéique centré autour du métabolisme des ARN et révèle de nouvelles protéines engagées dans cette voie métabolique. De plus, l'étude de la catalyse par l'ARN en prenant les introns de groupe II comme système modèle permet de tirer des enseignements qui peuvent s'appliquer au système plus complexe de l'épissage des introns des prémessagers nucléaires.

Mots clés:
ARN
épissage
intron auto-catalytique
double-hybride
triple-hybride
Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Our main domain of interest is the RNA metabolism using the yeast Saccharomyces cerevisiae as model organism. Our genomic approach using the two-hybrid technique defines a network of interactions focused on nuclear RNA metobolism. It leads to the identification and characterization of novel nuclear factors. Moreover, we use group II intron ribozymes as model systems to study RNA catalysis of splicing reactions. General rules are established that likely apply to related but more complex systems (the spliceosome) found in the nucleus.

Keywords:
RNA
Splicing
self-splicing intron
double-hybride
triple-hybride
Saccharomyces cerevisiae

Texte du rapport

L'unité de Génétique des Interactions Macromoléculaires a été crée en Janvier 1999. Elle est dirigée par A. Jacquier. Cette unité est issue du Laboratoire du Métabolisme des ARN qui avait été créé en Janvier 1995 pour une durée de quatre ans.

THEME 1: Elaboration d'un réseau d'interactions protéiques centré autour des facteurs d'épissage des ARN pré-messagers nucléaires.

Afin de construire un réseau d'interactions entre protéines impliquées dans le métabolisme des ARN, nous utilisons le double-hybride en criblages exhaustifs et réitératifs. L'approche génomique que nous avons mise au point consiste à utiliser en premier lieu comme appâts des facteurs d'épissage connus. L'analyse exhaustive de la banque double-hybride nous permet de classer les candidats en catégories de valeurs prédictives différentes. Parmi les proies sélectionnées, celles ayant les valeurs prédictives les plus fortes sont utilisées a nouveau comme appât. Ces cribles réitératifs permettent la constitution de réseaux d'interactions connectant des facteurs inconnus avec des facteurs connus. Depuis 1998, notre effort s'est porté en particulier sur les protéines à motif Sm. Ces protéines entrent dans la composition des complexes ribonucléoprotéiques (snRNP) qui interviennent dans la réaction d'épissage. Nous avons montré l'existence de 8 nouvelles protéines qui ont été appelées protéines Lsm (5 ont été identifiées au cours de nos cribles). Le réseau d'interactions construit autour des Lsm a montré qu'elles étaient connectées entre elles suggérant l'existence d'un complexe Lsm. Par ailleurs, ces protéines sont connectées à des facteurs d'épissage interagissant en particulier avec l'ARN U6. De façon surprenante mais non ambiguë, les Lsm sont connectées avec des protéines impliquées dans la dégradation des ARNm. Ceci suggère que le complexe Lsm pourrait être engagé dans une autre voie métabolique, à savoir la dégradation des ARNm.

THEME 2: Mise en évidence de nouveaux facteurs impliqués dans le métabolisme des ARN.

Les cribles réitératifs ont révélé des protéines de fonction inconnue. Les candidats sur lesquelles une analyse fonctionnelle est réalisée sont choisis selon des critères de connectivité et de spécificité. L'appartenance spécifique à un réseau ou un ensemble donné est déterminante. Une demi-douzaine de ces candidats font l'objet d'une analyse fonctionnelle. Des mutants de délétions ou conditionnels ont été obtenus pour les différents candidats. Des tests de coléthalité entre souches mutantes pour des candidats connectés dans le réseau ont été réalisés. Des souches contenant une copie du gène étiqueté pour produire la protéine de fusion ont été construites afin de purifier, à partir d'extraits cellulaires totaux, les protéines associées à la protéine étiquetée, ceci afin de vérifier " in vivo " l'existence du complexe observé en double-hybride. La nature des tests fonctionnels à réaliser est dictée par la nature du réseau d'appartenance. Ceci est particulièrement frappant au sein du réseau Lsm. Par exemple, la protéine inconnue uniquement connectée aux Lsm et aux protéines de dégradation des ARNm devra être testée pour son rôle éventuel dans la dégradation des ARNm. Par ailleurs, des analyses biochimiques et génétiques portant sur les Lsm ont montré que ces protéines étaient associées à l'ARN U6. Par ailleurs, des tests de coimmunoprécipitation suggèrent que ces protéines sont " in vivo " impliquées dans un même complexe; ce qui confirme les résultats qui avaient été obtenus en crible double-hybride.

THEME 3: Amélioration de la techique triple-hybride afin de l'appliquer à des criblages génétiques exhaustifs.

Les interactions protéine-ARN jouent un rôle crucial dans de nombreux processus biologiques, en particulier dans l'épissage. Le triple-hybride permet d'identifier des interactions entre protéines et ARN. Cette technique met en jeu trois partenaires: (i) un ARN hybride constitué de l'ARN à étudier fusionné au motif ARN reconnu par la protéine virale MS2. L'ARN fait un pont pour reconstituer un activateur transcriptionnel qui va permettre l'expression d'un gène reporteur. (ii) du domaine d'interaction à l'ARN de la protéine MS2 fusionné au domaine de liaison à l'ADN de LexA. Cette protéine hybride va à la fois s'ancrer en amont du gène reporteur et se lier à l'ARN hybride. (iii) d'une banque de peptides fusionnés au domaine d'activation de Gal4 afin d'identifier les protéines qui interagissent avec l'ARN étudié (la même banque que celle utilisée pour le double-hybride). Plusieurs améliorations doivent être apportées à cette technique afin de pouvoir l'utiliser pour cribler notre banque de manière exhaustive. La souche de levure doit être modifiée pour pouvoir utiliser la même stratégie que pour le double-hybride (méthode par croisement). Le système de production de l'ARN hybride sera rendu inductible et donc contrôlable pour vérifier que l'activation du gène reporteur est dépendante de l'ARN. Enfin, la protéine fusion MS2 génère à elle seule, en l'absence d'un partenaire ARN, un très fort bruit de fond d'interactions non spécifiques. Ceci est incompatible avec une analyse exhaustive de nos banques. Des systèmes utilisant des protéines autres que MS2 sont testés.

THEME 4: Etude de la maturation des ARN par l'endonuclease double-brin Rnt1p.

Nous avons montré que la protéine Rnt1, homologue de la RnaseIII bactérienne, participe à la maturation d'un grand nombre de petits ARN stables non traduits. L'analyse comparative d'un grand nombre de substrats pour cette protéine a permis d'identifier un consensus, la tétraboucle AGNN. Cette séquence est importante fonctionnellement car, quand on mute ce signal, on abolit totalement le clivage par Rnt1. Des études par interférence de modifications chimiques et de pontage au laser ont montré que ces boucles constituent des sites de reconnaissance directs pour Rnt1. Le rôle de la tétraboucle dans la reconnaissance par l'enzyme sera déterminé et des études structurales seront menées en utilisant un système modèle purifié constitué par un substrat modèle en épingle à cheveu et la protéine Rnt1p recombinante exprimée chez E.coli. Par ailleurs, plusieurs partenaires protéiques de la RNase III eucaryote ont été sélectionnés en crible 2-hybride. Certains semblent impliqués dans des phénomènes de transport nucléo-cyoplasmique ou dans l'équilibre entre mitochondries et noyau; ce qui ouvre une perspective de recherche vers la dynamique cellulaire de la RNase III eucaryote. L'implication éventuelle de Rnt1 dans la maturation d'autres ARN que les ARN stables, tels que les ARN messagers est envisagée. Un projet de crible exhaustif par micropuces à ADN est en cours de réalisation afin d'identifier les cibles polyadénylées de cette enzyme, si elles existent.

THEME 5: Construction d'une carte d'interactions protéiques du virus de l'hépatite C (HCV)

Le virus de l'hépatite C est responsable d'infections chroniques qui conduisent souvent à des carcinomes hépatiques. C'est un virus à ARN simple brin positif de la famille des Flaviviridae, de 10 kb environ et qui code pour une seule polyprotéine. Une dizaine de produits de clivage sont identifiés, dont certains correspondent à des protéines de structure du virion et d'autres à des facteurs non structuraux. La protéolyse de la polyprotéine fait intervenir des peptidases cellulaires et une protéase codée par le virus. Peu de données existent sur l'association éventuelle des protéines non structurales. Il nous a donc semblé que ce virus était un bon modèle pour tester une approche génomique systématique par double-hybride. L'utilisation de banques génomiques HCV aléatoires a permis d'identifier des interactions déjà décrites ainsi que plusieurs nouvelles interactions. Ce projet a été entrepris en collaboration avec M. Flajolet et C. Transy du laboratoire dirigé par P. Tiollais (Institut Pasteur).

THEME 6: Etude du système modèle des introns auto-catalytiques de groupe II, pour les aspects mécanistiques de l'épissage.

Les introns de groupe II constituent un modèle attrayant pour étudier les réactions d'épissage car ils présentent un même schéma réactionnel que l'excision des introns de pre-mRNA nucléaires. Cependant, alors que l'épissage de pre-mRNA nucléaires fait intervenir une machinerie complexe appelée "spliceosome" impliquant au moins une centaine de facteurs, les introns de groupe II sont capables de s'auto-épisser in vitro en l'absence de tout facteur exogène. Nous sommes d'une part impliqués dans la détermination de l'architecture tridimensionnelle des introns de groupe II. La connaissance de cette structure devrait nous aider à comprendre les mécanismes qui confèrent à ces molécules leurs propriétés enzymatiques. Nous avons d'autre part mis au point des tests enzymatiques nous permettant d'étudier les étapes catalytiques des réactions d'épissage. Nous utilisons ces essais pour étudier le rôle des ions métalliques dans la catalyse ainsi que pour définir les sites de l'intron directement impliqués dans le site actif du ribozyme.Enfin, la mise au point d'un système de sélection in vitro nous permet d'aborder les questions du repliement de l'ARN et de la catalyse d'une manière originale.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Odile LABOUISE

Chercheurs de l'unité

Alain JACQUIER          DR2 CNRS, Chef de l'Unité
Pierre LEGRAIN          DR2 CNRS
Guillaume CHANFREAU     CR2 CNRS
Micheline FROMONT       CR1 CNRS

Stagiaires de l'unité

Anne COUSTY             Etudiante stagiaire DEUST mi-temps
Laurence DORE           Etudiante en DEA
Laura FERRI             Post-doc

Autre personnel de l'unité

Laurence DECOURTY       Technicienne Supérieure Institut Pasteur
Alexis NOLTE            Assistant de Recherche Institut Pasteur (Septembre 99)
Adeline SIMON           Technicienne Supérieure CDD (détachée de l'INRA)
Florence RICARD         Ingénieur de Recherche CDD

Publications de l'unité

1998

UI - 98315064
Chanfreau G., Rotondo G., Legrain P., Jacquier A.: Processing Of a Dicistronic Small Nucleolar Rna Precursor By the Rna Endonuclease Rnt1. EMBO J 1998, 17:3726-3737.

UI - 99057976
Chanfreau G., Legrain P., Jacquier A.: Yeast RNase III as a key processing enzyme in small nucleolar RNAs metabolism. Journal of Molecular Biology 1998, 284:975-88.

UI - 98188276
Cho R. J., Fromont-Racine M., Wodicka L., Feierbach B., Stearns T., Legrain P., Lockhart D. J., Davis R. W.: Parallel Analysis of Genetic Selections Using Whole Genome Oligonucleotide Arrays. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95:3752-3757.

UI - 98283447
Nolte A., Chanfreau G., Jacquier A.: Influence of substrate structure on in vivo ribozyme activity of a group II intron. RNA 1998, 4:694-708.

UI - 98241253
Rain J. C., Rafi Z., Rhani Z., Legrain P., Kramer A.: Conservation of functional domains involved in RNA binding and protein-protein interactions in human and Saccharomyces cerevisiae pre-mRNA splicing factor SF1. RNA 1998, 4:551-565

UI - 98298258
Siomi M. C., Fromont M., Rain J. C., Wan L., Wang F., Legrain P., Dreyfuss G.: Functional conservation of the transportin nuclear import pathway in divergent organisms. Mol Cell Biol 1998, 18:4141-4148.

1999

UI - 99175114
Deme E., Nolte A., Jacquier A.: Unexpected metal ion requirements specific for catalysis of the branching reaction in a group II intron. Biochemistry 1999, 38:3157-67.

Vidal M., Legrain P.: The yeast forward and reverse "n"-hybrid systems. Nucleic Acids Res. 1999, 27:919-929

Chanfreau, G., Gouyette, C., Schwer, B. and Jacquier, A.: Trans-complementation of the second step of pre-mRNA splicing by exogenous 5' exons. RNA 1999, sous presse

Fromont-Racine M., Mayes A.E., Brunet-Simon A., Rain J-C., Colley A., Dix I., Joly N., Beggs J.D., Legrain P.: Genome-wide yeast protein interaction screens reveal functional networks involving Sm-like proteins. (soumis)

Flajolet M., Rotondo G., Bergametti F., Inchauspé G., Tiollais P., Transy C., Legrain P.: A genome-based strategy generates a protein interaction map of the hepatitis C virus. (soumis)

BREVETS

A fast and exhaustive method for selecting a prey polypeptide interacting with a bait polypeptide of interest. Application to the construction of maps of interactor polypeptides. déposé aux USA le 18 Février 1998 par M. Fromont-Racine, P. Legrain & J.-C. Rain.

Legrain P, Fromont-Racine M. 1998. Screening interactor molecules with whole genome oligonucleotide or polynucleotide arrays.

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