Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Genetique Moleculaire

CNRS URA 1773


Responsable : Pugsley Anthony P. (max@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L'unité de Génétique Moléculaire étudie plusieurs processus fondamentaux chez la bactérie Escherichia coli: l'assemblage de l'enveloppe, la sécrétion de protéines, la formation de pili et la régulation de transcription par la protéine MalT, activateur spécifique des gènes impliqués dans l'assimilation de maltose et maltodextrines. Une combinaison d'approches biochimiques et génétiques est mise en oeuvre afin de comprendre les mécanismes moléculaires de ces processus.

Abstract

The Molecular Genetics units studies protein secretion and gene transcription regulation in Escherichia coli. Model systems for these studies are secretion of an amylase, assembly of pili and the mechanisms of lipoprotein sorting in the E. coli cell envelope, and the MalT transcription activator of the maltose regulon. The unit uses genetic, biochemical, structural and biophysical approaches in all aspects of its work.

Texte du rapport

Protéine MalT : activateur de transcription chez E. coli (Evelyne Richet)

Depuis de nombreuses années, nos travaux portent sur MalT, l'activateur transcriptionnel du régulon maltose. Ce régulon comprend sept opérons codant les protéines nécessaires à l'utilisation des produits de dégradation de l'amidon comme source de carbone. Notre objectif est de déterminer comment l'activité de MalT est régulée et d'élucider les mécanismes par lesquels, seule ou en coopération avec la protéine régulatrice CRP, MalT active l'initiation de la transcription à partir des promoteurs des opérons maltose. MalT est le représentant le mieux connu d'une nouvelle famille d'activateurs transcriptionnels bactériens de 100 kDa. La protéine MalT n'est active qu'en présence d'ATP et de maltotriose, l'inducteur.

Diverses observations indiquent que la fixation de MalT sur ses sites de reconnaissance au niveau des promoteurs maltose met en jeu une oligomérisation de la protéine. En utilisant des approches biophysiques, nous avons récemment analysé la structure quaternaire de MalT en solution en présence et en absence des ses effecteurs positifs. Nous avons ainsi montré qu'en l'absence de ligands, la protéine est monomérique et que l'ATP et le maltotriose induisent la multimérisation de MalT. Le multimère formé est vraisemblablement un tétramère ou un hexamère. Des études par microscopie électronique couplées à des analyses d'image (en collaboration avec E. Larquet, Institut Pasteur) devraient nous permettre de définir la structure oligomérique de la protéine au sein des complexes nucléoprotéiques formés au niveau des différents types de promoteurs maltose.

Des études génétiques ont montré que les protéines MalK, MalY et Aes régulent négativement l'expression du régulon maltose en interférant avec l'action de MalT. Nous avons entrepris de disséquer le phénomène de répression par MalY et mis en évidence un mécanisme de régulation original selon lequel la protéine MalY inhibe la fixation de l'inducteur en interagissant directement avec MalT.

Pour être mieux à même de comprendre comment tous ces signaux régulateurs sont intégrés au niveau de la protéine, nous avons entrepris une étude fonctionnelle et structurale de MalT. Nous avons en particulier montré que la protéine comporte quatre domaines, que nous avons purifié séparément et dont la caractérisation est en cours.

Sécrétion de la pullulanase chez E. coli. (Anthony P. Pugsley)

La pullulanase est une enzyme amylolytique sécrétée par Klebsiella oxytoca. Le clonage de son gène de structure ainsi que 12 autres gènes permettent sa synthèse et sa sécrétion chez E. coli, où les mécanismes moléculaires de sa sécrétion sont étudiés. Les 12 gènes de sécrétion codent des protéines qui devraient toutes être impliquées dans la formation d'un complexe protéique, appelé le sécréton, qui permet à la pullulanase de franchir la membrane externe de la bactérie, son transport au travers de la membrane cytoplasmique étant assuré par le système Sec. Parmi ces 12 protéines, deux sont localisées dans la membrane externe où elles forment un complexe stable composé de 12 monomères de chacune d'entre elles. L'analyse de ce complexe par microscopie électronique révèle une structure en forme de tonneau qui correspondrait au conduit par lequel la pullulanase traverserait la membrane externe. Les dix autres protéines formeraient une structure permettant la reconnaissance du substrat (la pullulanase), le contrôle de l'ouverture et de la fermeture du canal et l'assemblage de la totalité du sécréton. Nos études actuelles visent à mettre en évidence les interactions entre les protéines qui composent le sécréton. Dans ce but, nous purifions et nous analysons l'ensemble du sécréton ainsi que des sous-complexes stables de celui-ci.

Formation de pili de type IV chez E. coli (Anthony P. Pugsley).

E. coli K-12 possède deux systèmes génétiques hautement similaires à celui du sécréton de la pullulanase. D'après les analyses des séquences de ces gènes et leur comparaison avec des gènes homologues, l'un de ces systèmes serait impliqué dans la sécrétion d'une protéine inconnue tandis que l'autre serait impliqué dans la biogenèse de pili de type IV. Ces derniers, souvent impliqués dans la pathogénicité d'autres bactéries, n'avaient jamais été mis en évidence chez E. coli K-12. Ceci semble s'expliquer par le fait que les gènes identifiés ne sont pas exprimés. A ce jour, nous n'avons pas réussi à augmenter leurs niveaux d'expression, ni par des approches génétiques, ni par changement de conditions de culture. Cependant, nous avons montré que le gène codant la piline majeure d'E. coli K-12 peut être exprimé chez Pseudomonas aeruginosa, où son produit est assemblé en pili sous la dépendance des gènes nécessaires à la formation des pili endogènes de cette bactérie.

Triage de lipoprotéines (Anthony P. Pugsley).

La localisation correcte et efficace des protéines de l'enveloppe bactérienne leur permet de fonctionner. Nous étudions la localisation d'une catégorie de ces protéines exportées, les lipoprotéines, qui possèdent une extrémité N-terminal acylée, assurant leur ancrage dans une membrane de l'enveloppe. Certaines lipoprotéines sont localisées dans la membrane externe tandis que d'autres sont ancrées dans la membrane interne. Le triage des lipoprotéines est assuré grâce à la reconnaissance d'un signal de triage par une machinerie composée d'au moins trois protéines que nous étudions en utilisant essentiellement une approche génétique. D'après nos études, le signal de triage est composé d'un seul acide aminé, celui en position +2 de la chaîne polypeptidique après clivage du peptide signal. La localisation dans la membrane cytoplasmique est spécifiée par la présence d'aspartate, de phenylalane, de tryptophane, de tyrosine ou de proline en position +2 tandis que tout autre acide aminé dirige la protéine vers la membrane externe.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Armelle LAVENIR

Chercheurs de l'unité

Anthony PUGSLEY
Evelyne RICHET
Odile POSSOT
Olivier DANOT

Stagiaires de l'unité

Nathalie SAUVONNET
Olivera FRANCETIC
Valérie SCHREIBER
Nicolas BAYAN
Anke SEYDEL
Guillaume VIGNON
Frank EBEL

Autre personnel de l'unité

Dominique VIDAL-INGIGLIARDI
Ingrid GUILVOUT
Nathalie NADEAU
Maria REYNGOUD

Publications de l'unité

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