Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Génétique et Biochimie du Développement

CNRS URA 1960


Responsable : ROUGEON François (frougeon@pasteur.fr )

Résumé du rapport

Les travaux de notre laboratoire sont centrés autour de deux axes principaux : (i) l'analyse des mécanismes moléculaires conduisant à l'expression clonale des immunoglobulines dans les lymphocytes B ; (ii) l'analyse des mécanismes qui contrôlent au niveau transcriptionnel et post-traductionnel l'expression de la rénine et de polypeptides propres à la glande sous-maxillaire des rongeurs.

Abstract

Work in our laboratory is centered around two main themes : (i) molecular mechanisms underlying the clonal expression of immunoglobulin genes in B lymphocytes ; (ii) transcriptional and post-transcriptional regulation of the expression of renin and other rodent submaxillary gland-specific polypeptides.

Texte du rapport

  1. Analyse des séquences responsables en cis de la régulation du réarrangement des gènes codant pour les immunoglobulines (Michele Goodhardt)

L'expression des gènes codant pour les immunoglobulines (Ig) et le récepteur des cellules T nécessite l'assemblage préalable de l'exon variable, à partir de segments géniques distincts, V, D et J. Ces événements de recombinaison site-spécifique, qui ont lieu dans les précurseurs des lymphocytes B et T, sont régulés au cours du développement des cellules lymphocytaires et sont spécifiques de la lignée B ou T.

Afin d'identifier les éléments impliqués dans la régulation du réarrangement des gènes des Ig, nous avons construit des souris transgéniques portant différentes constructions de gènes de chaîne légère k non réarrangés. Ces expériences ont mis en évidence deux types d¹éléments intervenant dans la régulation du réarrangement des gènes k : d¹une part, des séquences activatrices associées à l¹enhancer intronique, qui induisent la recombinaison et d¹autre part, des séquences de type silencer qui confèrent la spécificité du réarrangement en restreignant la recombinaison aux précurseurs. De plus, nos résultats soulignent l¹importance de la chromatine dans la régulation de la recombinaison et montrent que la différentiation des lymphocytes B est associée à une réorganisation de la structure chromatinienne des gènes des Ig.

2. Expression de la terminale transférase au cours du développement (Noëlle Doyen)

La terminale déoxynucléotidyl transférase (TdT) est une enzyme impliquée dans la génération de la diversité des immunoglobulines et des récepteurs T, puisqu'elle est responsable de l'addition de nucléotides aléatoires, dits N, aux jonctions formées au cours de la recombinaison entre les segments géniques V, D et J. Absente au cours de la vie foetale, la TdT n'est exprimée que quelques jours après la naissance.

Nos travaux sont centrés autour de trois axes : l¹analyse des interactions entre la TdT et les facteurs intervenant dans le processus de recombinaison ; l¹étude des mécanismes responsables de l¹expression différentielle de la TdT au cours du développement. Enfin, en étudiant la réponse immune à différentes stimulations antigéniques, dans un modèle de souris transgénique exprimant la TdT, dès le stade foetal, nous cherchons à préciser le rôle de la régulation temporelle de la diversité N dans le système immunitaire.

3. Analyse in vitro des protéines partenaires de la recombinaison V(D)J (Catherine Papanicolaou)

Nous avons développé une nouvelle méthode de production de protéines hétérologues chez E.coli (DB/MD-99/112) qui nous a permis d'obtenir en large quantité les deux isoformes de TdT murine, une forme de TdT délétée du premier tiers N-terminal et néanmoins active (TdTD129) ainsi que les protéines RAG1 et RAG2 non tronquées: (i) nous comparons les propriétés catalytiques des deux TdT murine; (ii) nous avons construit et analysons une série de variants de la TdT, afin d'identifier les résidus essentiels pour l'activité catalytique, ainsi que ceux impliqués dans la sélectivité de la TdT pour ses substrats ADN simple brin et nucléotides ; (iii) en collaboration avec Marc Delarue (unité d'Immunologie Structurale), nous avons cristallisé la TdTD129. Ces cristaux sont actuellement en cours d'analyse; (iv) nous développons un système de recombinaison acellulaire avec les protéines RAG1 et RAG2 entières.

4. Caractérisation d'une nouvelle voie de régulation endocrinienne impliquant une glande salivaire majeure, la glande sous-maxillaire (Catherine Rougeot, Isabelle Rosinski-Chupin)

Nous avons précédemment caractérisé l'un des ARNm majoritaires de la glande sous-maxillaire (GSM) du rat mâle adulte. Cet ARN code pour une préproprotéine structurellement apparentée aux précurseurs hormonaux du système endocrinien et nommée SMR1. Trois peptides, produits du clivage sélectif de SMR1 au niveau des sites de maturation dibasiques (paires de résidus arginine) ont été caractérisés, in vivo, à partir de la glande sous-maxillaire et de la salive du rat adulte. La biosynthèse et la sécrétion locale et systémique de ces peptides sont sujettes à une régulation différentielle dépendant de l'organe, du sexe, de l'âge du rat, du taux circulant des hormones de l'axe hypothalamo-gonadique et des conditions de stimulation de la GSM par le système nerveux périphérique. Nous cherchons à établir quels sont les mécanismes transcriptionnels et post-transcriptionnels mis en jeu dans cette régulation. Afin d'obtenir des indications sur leur rôle physiologique, nous avons recherché les tissus-cibles périphériques de ces hormones peptidiques. Leur identification, en particulier au niveau du rein, de la dent et de l'os suggère que le SMR1-pentapeptide est impliqué dans la régulation hormonale du transport et de l'utilisation des minéraux et dans le maintien de l'équilibre hydrominéral de l'organisme.

Le gène codant SMR1 appartient à une famille multigénique qui a déjà été caractérisée en partie chez la souris et le rat. Nos efforts portent actuellement sur la caractérisation des gènes de cette famille chez l'homme. Nous cherchons par ailleurs à préciser les événements qui ont abouti à la diversification des gènes de cette famille au cours de l'évolution.

5. Immortalisation des cellules épithéliales de la glande sous-maxillaire (Brid Lefévère-Laoide)

Nous avons établi et caractérisé deux lignées de cellules, à partir de GSM de souris transgéniques pour l'antigène T de SV40 : lignée SIMS (en collaboration avec Mme. O. Kellermann et M. C. Babinet, Institut Pasteur) soit pour l'antigène T du polyome : lignée SIMP (PyLT : M. F. Cuzin, Nice) et nous sommes parvenus à recréer, in vitro, les structures présentes, in vivo, dans la glande sous-maxillaire. Les deux lignées cellulaires épithéliales que nous avons établies représentent donc un modèle cellulaire de choix pour l'étude des mécanismes impliqués dans l'expression tissu-spécifique et hormono-dépendante de la rénine sous-maxillaire chez la souris.

Mots clefs :

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

BOUTOUT Laurence, IP, lboutout@pasteur.fr

Chercheurs de l'unité

ROSINSKI-CHUPIN Isabelle, IP, Email : ichupin@pasteur.fr DOYEN Noëlle, IP, E-mail : ndoyen@pasteur.fr GOODHARDT Michèle, CNRS, E-mail : migood@pasteur.fr LEFEVERE-LAOIDE Brid, IP, E-mail : blaoide@pasteur.fr PAPANICOLAOU Catherine, CNRS, E-mail : papanico@pasteur.fr ROUGEOT Catherine, IP, E-mail : crougeot@pasteur.fr

Stagiaires de l'unité

BENTOLILA Laurent, Thèse
BOULE Jean-Baptiste, Thèse, E-mail : jboule@pasteur.fr COQUILLEAU Isabelle, Thèse, E-mail : icoq@pasteur.fr HUAULME Jean-François, Thèse, E-mail : jhuaulme@pasteur.fr JOHNSON Emmett, Stagiaire
MAES Jérôme, Thèse, E-mail : jmaes@pasteur.fr NOURRIT Françoise, Thèse, E-mail : fnourrit@pasteur.fr

Autre personnel de l'unité

CAVELIER Patricia, CNRS, E-mail : cavelier@pasteur.fr HERMITTE Véronique, IP, E-mail : hermitte@pasteur.fr KLIMCZAK Martine, IP, E-mail : mfanton@pasteur.fr

Publications de l'unité

Señorale-Pose, M., Jacqueson, A., Rougeon, F. and Rosinski-Chupin, I. (1998). Acinar cells are target cells for androgens in mouse submandibular glands. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 46, 669-678. (Numéro Medline 98230719)

Nourrit, F., Doyen, N., Kourilsky, P., Rougeon, F. and Cumano, A. (1998). Extensive junctional diversity of Ig heavy-chain rearrangements generated in the progeny of single fetal multipotent hematopoietic cells in the absence of selection. J. Immunol. 160, 4254-4261. (Numéro Medline 98233671)

Smith, J., Andrau, J.C., Kallenbach, S., Laquerbe, A., Doyen, N. and. Papadopoulo, D. (1998). Abnormal rearrangements associated with V(D)J recombination in Fanconi anemia. J. Mol. Biol. 281, 815-825. (Numéro Medline 98387890)

Arbibe, L., Koumanov, K., Vial, D., Rougeot, C., Faure, G., Havet, N., Longacre, S., Vargaftig, B.B., Bereziat, G., Voelker, D.R., Wolf, C. and Touqui, L. (1998). Generation of lyso-phospholipids from surfactant in acute lung injury is mediated by type II phospholipase A2 and inhibited by a direct surfactant protein A-phospholipase A2 protein interaction. J. Clin. Invest 102, 1152-1160. (Numéro Medline 98411371)

Marshall, A.J., Doyen, N., Bentolila, L.A., Paige, C.J. and Wu, G.E. (1998). Terminal deoxynucleotidyl transferase expression during neonatal life alters DH reading frame usage and Ig receptor-dependent selection of V regions. J. Immunol. 161, 6657-6663. (Numéro Medline 99077530)

Boulé J.B., Johnson E., Rougeon F. and Papanicolaou-Quentzel C. (1998). High-level expression of murine terminal deoxynucleotidyl transferase in Escherechia coli grown at low temperature and overexpressing argU tRNA. Molecular Biotechnology 10, 199-208. (Numéro Medline 99136874

Rougeot, C., Rosinski-Chupin, I. and Rougeon, F. (1998). Novel genes and hormones in salivary glands : from the gene for the submandibular rat 1 protein (SMR1) precursor to receptor sites for SMR1 mature peptides. Biomedical Reviews. 9, 17-32.

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