Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Dynamique Lymphocytaire

CNRS URA1961


Responsable : Freitas, Antonio (afreitas@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Chez un vertébré adulte, le nombre total de lymphocytes est sous un contrôle homéostatique assez strict. Il y a cependant une production continue de nouvelles cellules dans la moelle osseuse et le thymus. A la périphérie, les stimulations antigéniques induisent la division cellulaire et par conséquent, la production de nouvelles cellules. Le nombre total de cellules étant limité, chaque lymphocyte ne peut survivre qu'après la mort d'autres cellules. Nous postulons que la sélection des répertoires lymphocytaires ne dépend pas uniquement des interactions entre lymphocytes et antigènes, mais qu'elle est aussi modulée par la compétition cellulaire. Le Laboratoire des Dynamiques Lymphocytaires a comme objectifs: a) étudier les mécanismes d'homéostasie ; b) étudier les dynamiques des populations lymphocytaires: taux de production, de survie et de mort cellulaire ainsi que les taux de renouvellement de ces populations ; c) étudier le rôle de la compétition cellulaire dans la régulation du système immunitaire, la tolérance et la mémoire immunologique ; d) établir des modèles mathématiques des mécanismes de compétition et de sélection lymphocytaire.

Abstract

Immune responses to infectious agents requires the rapid proliferation of rare specific precursors. The increase in the numbers of a small subset of cells takes place within the constrains imposed by a strict control of cell numbers. Thus the kinetics (and ultimate outcome) of immune responses to infectious agents cannot be understood without an understanding of the homeostatic control of lymphocyte numbers. In mature adult vertebrates and as for any other organ or tissue, the immune system is under a strict homeostatic control of cell numbers. In the mouse and in the course of the first weeks of post-natal life, lymphocyte populations increase in size; the kinetics of lymphocyte accumulation during the ontogeny of the immune system show a density dependent growth curve i.e. it increases in a saturating manner with resource availability. In the adult mouse "de novo" B and T cell production continues in the bone marrow and thymus. Antigen stimulation also induces cell division in the peripheral cell pools. In a kinetic steady state where cell production equals cell loss and the total number of cells is kept constant each newly produced lymphocyte can only establish itself upon loss of other resident cells : modulation of peripheral repertoires faces a problem of substitution.Selection of lymphocyte repertoires well be determined not only the interactions between each lymphocyte and its ligands, but also by the number and type of other competitor populations. The efficacy of an immune response to infection is determined by: 1) the repertoires which were previously selected and are available before infection, 2) the primary immune response and
3) the establishment and maintenance of memory responses. The aims of our laboratote are:
a) the study of lymphocyte homeostasis. b) the study of lymphocyte populations dynamics c) the study of the role of cellular competition in immune regulation d) to establish new models of lymphocyte selection via competition.

Texte du rapport

  1. Homéostasie: Pourquoi le nombre de cellules B est-il celui que l'on observe? Est-il le résultat d'une production insuffisante ou inefficace de nouvelles cellules B? Est-il limité à la périphérie par une quantité insuffisante d'espace ou de "ressources"? Nous avons construit des souris chimériques reconstituées avec des mélanges de cellules précurseurs de moelle osseuse (MO) de souris normale et de souris mMT (incapable de produire des cellules B) en proportions variables. Nous avons constaté que les groupes de chimères contenant plus du tiers du nombre normal de cellules pro et pre-B présentaient un nombre de cellules B périphériques identique à celui observé dans les conditions physiologiques normales. Le maintien du nombre physiologique de cellules B périphériques dépend cependant d'une production minimale et continue de nouvelles cellules (chez les chimères avec un nombre très réduit de cellules pre-B, le nombre de cellules B périphériques est diminué). L'étude des taux de production de cellules B par incorporation de BrdU in vivo nous a permis de conclure que: a) un tiers de la production normale de cellules B suffit pour remplir le compartiment périphérique des lymphocytes B ; b) le taux de production de lymphocytes B est constant et indépendant du nombre de cellules B périphériques ; contrairement à ce que l'on observe pour d'autres cellules hématopoïétiques (érythrocytes). Il n'y a donc pas de rétro-contrôle "feed-back" du compartiment périphérique sur le taux de production médullaire Nous avons également réalisé des parabioses entre différentes lignées de souris (établissement d'une circulation croisée entre deux animaux). Cette approche expérimentale permet de conserver les compartiments centraux de chaque souris intacts, et d'étudier le mélange des populations matures, présentes initialement ou néoformées, dans les compartiments périphériques. L'analyse des parabioses entre souris normale et mMT a confirmé que la production cellulaire d'une seule souris est suffisante pour "remplir" les organes lymphoïdes secondaires de deux souris. En doublant les "ressources" disponibles, le nombre total de lymphocytes B est doublé. A la lumière de ces expériences, nous avons conclu qu’un nombre relativement limité de précurseurs lymphopoïétiques est suffisant pour reconstituer des animaux (parabioses [B6mMT/B6Ly5] et chimères [B6mMT/B6Ly5]). L'importance des ressources consommables indispensables aux cellules (antigènes, facteurs de croissance...) définit la taille des populations concernées, même si la production de cellules B est limitée dans la moelle osseuse. Dans les souris chimères (normale+mMT) nous avons vérifié que le nombre de cellules B activées, le nombre de cellules sécrétrices d'IgM, ainsi que les taux d'IgM sériques, étaient toujours constants quelque soit le nombre de cellules pre-B ou le nombre de cellules B matures. Lorsque le nombre de cellules B matures passe au-dessous d'un certain seuil, les compartiments terminaux (cellules activées, plasmocytes) sont préférentiellement remplis. Plus le nombre de cellules pre-B diminue, plus le ratio [cellules B au repos / cellules sécrétrices] décroît. Ce résultat indique que le contrôle homéostatique des populations B activées se fait de façon autonome par rapport au contrôle homéostatique des populations B au repos. Le système immunitaire montre une organisation hiérarchique qui a comme priorité de conserver les taux d'IgM sériques qui constituent une première barrière de défense, et d'assurer un réservoir de diversité chez les populations B au repos. Nous avons ensuite étudié le comportement des populations B périphériques en absence d'un compartiment de cellules précurseurs. Pour cela nous avons reconstitué des souris déficientes en cellules B (Rag2 -/-) avec des suspensions cellulaires de ganglions dans lesquels ne sont présentes que des cellules B et T matures (aucun précurseur hématopoïétique). Dans ces animaux, le devenir des cellules B matures suit une cinétique particulière: après une diminution initiale du nombre de cellules, on note une expansion cellulaire; le nombre de cellules atteint 15 jours après transfert persiste ensuite pendant au moins 4 mois. Ces cellules acquièrent un phénotype "activées": leur taille est augmentée, elles expriment fortement IgM, mais moins IgD. Elles n'expriment pas CD5 ou Mac1. Le nombre de cellules sécrétrices est très élevé dans ces animaux (10% des cellules B périphériques vs. 1% chez la souris normale) et le taux d'IgM sériques est normal. Un nombre limité de 4x106 cellules B est capable de reconstituer totalement les compartiments terminaux de la lignée B (plasmocytes, Ig sériques). Ce phénomène est complètement indépendant de la présence de cellules T, puisque l'on obtient le même résultat en réalisant des transferts de cellule B d'une souris CD3 -/- dans une souris Rag2 -/-. Des expériences réalisées au laboratoire avaient montré que le répertoire des familles de gènes VH des cellules B activées étaient différent de celui des cellules au repos. Ce résultat, couplé à d’autres données, suggérait que ces deux populations pouvaient être d’origine différente. En transférant des cellules périphériques dans des hôtes immunodéficients nous avons constaté que ces cellules B matures sont rapidement activées (modification de leurs molécules de surface, sécrétion d’IgM...). Ces cellules persistent pendant au moins 4 mois dans les receveurs. Il est donc possible que les plasmocytes spléniques de l’adulte soient générées par un pool de cellules peu permissif à l’arrivée de nouveaux lymphocytes. Le transfert de nombres variables de cellules B matures (103 à 5x107) nous a permis de constater que le taux de croissance des cellules transférées est assez lent et suggère que les cellules atteignent un nombre maximal 6 mois après transfert. Une fois de plus, l'homéostasie des populations de cellules activées est prioritaire. D'autres expériences ont été menées afin de déterminer le taux de substitution des cellules activées par des cellules néoformées dans la moelle osseuse. Dans ce cas, nous avons fait un transfert simultané de cellules B ganglionnaires et de cellules de MO portant un allotype différent. Les résultats suggèrent un taux de remplacement assez faible, ce qui semble confirmer l'autonomie des populations activées. Par ailleurs, nous avons constaté que ces populations de cellules B activées exercent un rétrocontrôle qui empêche la différentiation terminale (en cellules sécrétrices) d'une deuxième population de cellules B et l'arrivée en périphérie des nouvelles cellules B migrant à partir de la moelle osseuse. Les mécanismes responsables de ce rétrocontrôle sont à l’étude. Il semble que une fois qu’une population est installée, elle est plus difficile à remplacer et elle exerce un rétrocontrôle sur les nouvelles populations de cellules; ceci suggère que la sélection des cellules B activées suit la règle de "premier arrivé, premier servi".
  2. Compétition cellulaire B. Par définition, les phénomènes de compétition entre deux populations cellulaires doivent satisfaire au moins deux critères: a) modifier la taille relative de deux populations en compétition et b) modifier leurs dynamiques et leurs taux de survie. Dans notre laboratoire, nous avons conduit des expériences dites "de compétition cellulaire". Le protocole de "compétition" est le suivant: irradiation létale des souris hôtes puis reconstitution par injection i.v. de mélanges cellulaires contenant des quantités variables de cellules de moelle osseuse de plusieurs donneurs. En effet, nous pouvons transféré des mélanges de cellules de moelle osseuse, en proportion variable, issues de souris B6 (non-Tg) et de souris Tg pour un gène réarrangé d'Immunoglobuline (Ig). La contribution relative de chacune des populations issue de cellules de moelle osseuse injectées est analysée: lymphocytes B de la moelle osseuse, de la rate et de la périphérie du système immunitaire; cellules sécrétrices d'anticorps et immunoglobulines sériques. Nous pouvons donc analyser la reconstitution des cellules B et évaluer les mécanismes de sélection et de survie ainsi que les mécanismes de compétition cellulaire. Au cours de nos études, nous avons montré que: - Les cellules B d'une souris Tg ont la même capacité de reconstitution que les cellules d'une souris normale non-Tg. - Chez les souris chimères injectées avec des mélanges cellulaires, il y a sélection préférentielle des cellules B non-Tg. La proportion des cellules B dans les compartiments périphériques ne correspond donc pas aux proportions présentes dans l'inoculum. - La sélection périphérique des cellules B non-Tg est liée à l'expression d'Ig de surface. Elle n'est pas observée dans les compartiments des cellules précurseurs, pro-B et pre-B de la MO, ni dans d’autres compartiments de cellules hématopoïétiques (thymocytes ou cellules T). - La cinétique de reconstitution des cellules B périphériques dans les souris chimères suit une courbe de croissance qui dépend de la densité cellulaire (dite "courbe de Monod") avec une première phase d’expansion suivie d’une phase d’équilibre. - La sélection périphérique des cellules non-Tg n'est détectable qu'à partir de la 3ème semaine suivant le transfert, c'est-à-dire au moment où la pente de croissance cellulaire atteint le plateau (phase d’équilibre) et que la disponibilité des ressources diminue. Toutes ces observations indiquent que la présence d'une population cellulaire peut modifier la taille (nombre de cellules) d'une seconde population. Afin de mieux comprendre les mécanismes de sélection des cellules B non-Tg dans les chimères, nous avons étudié la cinétique de renouvellement et la durée de vie des deux types cellulaires (Tg et non-Tg) en utilisant une méthode de marquage des cellules avec du BrdU "in vivo". Un jour après l'administration de BrdU, 1 à 2% des cellules périphériques Tg ou non-Tg sont marquées. Les deux populations ont donc le même taux de division périphérique. Après six jours de marquage, 20-30% des cellules Tg et 10% des cellules non-Tg sont marquées. Nous concluons que la dominance périphérique des cellules B non-Tg se fait par accroissement de leur survie. Plus important: la comparaison des taux de marquage des lymphocytes B TG dans différentes souris chimères nous a montré que la survie des lymphocytes dépend de la présence et de la nature d'autres cellules compétitrices. Ces résultats démontrent que la durée de vie et la taille d'une population cellulaire peuvent être modifiées en présence d'une seconde population. C'est la preuve de l'existence de compétition cellulaire. Ces expériences indiquent clairement que la compétition cellulaire joue un rôle prépondérant dans la sélection des répertoires B. L’homéostasie du nombre de cellules B périphériques pourrait être déterminée par une quantité limitée de ressources. Des expériences de transfert cellulaire ont montré que des cellules B injectées à des hôtes adultes disparaissent rapidement. Par contre, les mêmes cellules B injectées à des nouveau-nés se multiplient et persistent pendant 3-4 semaines jusqu'à ce que l'hôte devienne adulte. Ces observations suggèrent qu'il n'y a pas de sélection des cellules B chez le nouveau-né au cours de l'expansion des lymphocytes, lorsque les ressources sont abondantes. A l'opposé, lorsque l'animal devient adulte, les ressources deviennent plus rares et la compétition s'établit. Nous avons comparé la survie de cellules B normales et SP6 Tg après transfert dans des nouveau-nés. A l’opposé de ce qui se passe chez les hôtes adultes, chez lesquels il y a une survie préférentielle des cellules B non-Tg, chez les souriceaux il n’y a pas de différence de survie entre les populations de cellules B non-Tg et SP6 Tg transférées. Afin d'étudier les mécanismes de compétition cellulaire parmi les populations B, nous avons aussi réalisé des parabioses entre souris normale et souris Ig Tg. Cette approche expérimentale permet de conserver les compartiments centraux de chaque souris intacts et d'étudier, dans les compartiments périphériques, la compétition cellulaire entre les populations matures présentes initialement et les populations néoformées. Lorsque l'on "parabiose" une souris normale avec une souris transgénique pour une IgM, on observe très clairement une dominance des lymphocytes B issus de la souris normale dans les rates des deux individus. Ces résultats suggèrent donc qu'il existe une compétition périphérique basée sur la diversité des Ig exprimées. Ces expériences tendent à montrer également que la taille de ces compartiments est déterminée par la compétition lymphocytaire et la quantité de ressources disponibles. La compréhension de la sélection des répertoires exige donc une nouvelle approche: l'étude des règles de compétition lymphocytaire et l’identification de type de ressources impliquées dans ces phénomènes. Nous avons déjà abordé plusieurs questions :
  3. En présence de compétiteurs, on doit s'attendre à des modifications de la "morphologie" d'une population puisqu'elle doit modifier sa niche écologique - "character displacement". En immunologie, cela peut se traduire par des modifications des interactions avec l'environnement ou des profils de réactivité. En utilisant une méthode d'analyse quantitative par Western blot, nous avons étudié les profils de liaison des anticorps produits par une population cellulaire en présence ou en absence de compétiteurs. Des résultats préliminaires suggèrent l'existence de modifications des profils de réactivité d'une population polyclonale de cellules B lorsqu'elle est en compétition avec une population de cellules B Tgs. Il est donc possible que la sélection des répertoires soit modulée de façon indirecte par les immunoglobulines de la souris (via les ressources). Ce mécanisme est différent de celui proposé dans la théorie du réseau où les interactions entre les Igs sont directes (via portions variables des Igs).
  4. Nous avons comparé la réimplantation et la compétition de deux ou trois populations de cellules transgéniques. Dans ce cas, on transfert un mélange de cellules de moelle osseuse de souris Ig transgéniques SP6 (anti-TNP de G. Koehler), MD4 (anti-HEL de A. Basten) M54 (anti-NIP de Imanishi-Kari) et H3L1 (transgéniques pour les chaînes lourde et légère d'un anticorps auto-réactif anti-globule rouge de souris de T. Honjo). Les résultats obtenus suggèrent que la spécificité des Ig de surface joue un rôle important dans la compétition cellulaire. L'utilisation des souris H3L1 a permis de montrer que le mécanisme d'induction de la tolérance B est plus complexe qu'une simple délétion des cellules B auto-réactives. Ces résultats montrent qu'il existe une hiérarchie dans la sélection des cellules B non-Tg>MD4=SP6>M54>H3L1 en absence de stimulation antigénique exogène.
  5. L'utilisation de souris transgéniques pour des molécules d'Ig dépourvues de portion variable (obtenues de M. Daniel Corcos), nous a permis de confirmer le rôle des Ig de surface dans la compétition lymphocytaire. Ces études suggèrent aussi l'existence de mécanismes de sélection positive dans la survie des cellules B périphériques au repos et le choix des répertoires d'anticorps. Plus important, ces études montrent que le BCR est essentiel à la survie des cellules B matures dans les compartiments périphériques. Il reste à déterminer quels sont les ligands reconnus qui permettent la survie des cellules B.
  6. L'étude de la réimplantation et de la compétition entre des lymphocytes B de souris déficientes pour la chaîne légère k des Igs (B6.Ig k -/-) et des cellules B d'une souris normale, semble démontrer la dominance des cellules normales portant un répertoire plus diversifié. Ceci confirme que l'une des priorités dans l'organisation du système immunitaire est de préserver une diversité maximale.
  7. D'autres expériences préliminaires, faites en collaboration avec M. Lamers (Freiburg), avec des souris déficientes pour l'IgD, et avec Kikutani avec des souris déficientes en CD40 semblent éliminer le rôle de l'IgD ou CD40 dans la survie périphérique des lymphocytes B.
  8. Nous avons aussi étudié le rôle de récepteurs et molécules autres que l'Ig. L'utilisation de souris mutantes non-répondeuses au LPS nous a permis de montrer que la compétition lymphocytaire est aussi influencée par d'autres récepteurs que les Igs.
  9. Finalement, nous avons étudié le rôle du gène de survie cellulaire bcl-2 dans la sélection et la compétition des lymphocytes. Nous avons étudié la compétition entre cellules normales et cellules transgéniques pour l'oncogène bcl-2 dans des chimères de MO ainsi que l'expression de bcl-2 chez les lymphocytes à longue durée de vie. Nous avons eu la preuve formelle du rôle de bcl-2 dans le contrôle de la longévité des lymphocytes B "in vivo" et de l'avantage de ces cellules dans les phénomènes de compétition lymphocytaire. Par ailleurs, en utilisant des souris double Tg, pour une Ig et pour bcl-2, nous avons constaté que l’expression constitutive de bcl-2 ne restitue que partiellement la capacité compétitive des cellules B Tg. Ces cellules restent toujours déficitaires quand elles sont en compétition directe avec des cellules B non-Tg ou des cellules simple Tg pour bcl-2. Ceci suggère que les voies de signalisation de survie transmises par le BCR et bcl-2 sont indépendantes. Nous avons établi deux lignées de souris Ig Tg sur fond Rag2-/-. Chez les souris " monoclonales " SP6, les cellules B sont absentes du "pool" périphérique. Il a été proposé que ces cellules sont éliminées dans la MO par l'auto réactivité anti-DNA de souris de ce Tg BcR. Chez les souris " monoclonales " MD4 anti-HEL, le nombre de cellules B périphériques est normal. Cependant, le taux d’IgM sérique est 10 fois inférieur à la normale. Ce dernier résultat montre qu’un seul type de spécifité peut remplir au complet le "pool" périphérique des lymphocytes B. Nous avons produit des souris doubles Tg sur fond Rag2-/-. Chez ces souris, les cellules B périphériques portent la spécificité SP6 (observations préliminaires). Les cellules B de ces souris expriment donc deux BcRs, ou plus, et l’intensité d’expression du marqueur idiotipique 20.5 (SP6) ou de la liaison HEL (MD4) à la surface est la moitié de l'intensité du normal. Nous avons comparé les capacités de compétition des cellules à un seul récepteur et à deux récepteurs (ou plus?) . Nos résultats préliminaires indiquent qu’il n’y a pas de préférence de sélection entre ces deux types de cellules. C’est-à-dire que le nombre de BcR ne paraît pas modifier la sélection périphérique des cellules B.
  10. Compétition cellulaire T. Il est probable que la compétition cellulaire soit une stratégie commune à toutes les classes de lymphocytes. Nous avons donc étudié la compétition et la sélection des lymphocytes T dans le thymus et à la périphérie. Le protocole de "compétition" est le suivant: irradiation des souris hôtes avec une dose létale de 850 à 900 rads, suivie par la reconstitution des souris par injection i.v. de mélanges cellulaires contenant des quantités variables de cellules de moelle osseuse de plusieurs donneurs. En effet, on peut faire des transferts de mélanges de cellules de moelle osseuse, en proportion variable, issues de souris B6 (non-Tg) et de souris transgéniques (Tg) pour un TcR. La contribution relative de chacune des populations issue de cellules de moelle osseuse injectées est analysée. Cette stratégie analyse la reconstitution des cellules T ainsi que leurs mécanismes de sélection et de survie et peut déterminer la présence des mécanismes de compétition cellulaire. Dans ces études, nous avons utilisé deux souches de souris transgéniques pour un TcR: anti-HY (souris transgéniques pour le TcR VaT3.70,Vb8.2 anti-antigène mâle HY de H. von Boehmer) et P14 (transgéniques pour le TcRVa2,Vb8.1 anti-LCMV de R. Zinkernagel); ainsi que des souches de souris congéniques pour les marqueurs Thy1 (Thy1.1 et Thy1.2) ou Ly5. Les résultats que nous avons obtenus confirment l'existence des phénomènes de compétition intra- et extra thymique parmi les cellules T. Il nous ont permis d'établir l'existence d'une hiérarchie dans la sélection périphérique des lymphocytes T CD8 en absence d'immunisation : non-Tg>P14>anti-HY. L'étude de la durée de vie des cellules Tg et non-Tg, en utilisant le marquage avec BrdU "in vivo" dans les chimères, montre qu'un nombre plus important de cellules CD8 non-Tg est marqué dès le premier jour d'administration de BrdU. Nous avons aussi observé que les cellules T CD8 dominantes expriment le marqueur d'activation ou de mémoire CD44. Tous ces résultats montrent que la dominance périphérique des cellules CD8 non-Tg se fait par activation et division à la périphérie et non par une survie prolongée au repos. Ces résultats confirment les différentes stratégies cinétiques des cellules B et T. Nous avons aussi réalisé des parabioses entre souris normale et souris TcR Tg. Nous avons comparé la survie et la persistance des cellules CD8 Tg et non-Tg dans des chimères et dans des souris parabiotiques. L'ensemble de ces résultats a permis de constater que la sélection périphérique des cellules T non-Tg est faite surtout pendant la phase de colonisation des organes lymphoïdes secondaires. Ensuite, la population installée est plus difficile à remplacer ce qui suggère que la sélection des cellules CD8 suit la règle de "premier arrivé, premier servi". Il nous fallait montrer que la présence de compétiteurs pouvait modifier la survie des populations de lymphocytes CD8. Après transfert de mélanges de lymphocytes CD8 normaux, Tg a-HY et Tg P14, dans des hôtes nu-nu athymiques (déficients en cellules T), nous avons constaté l'expansion de cellules CD8 non-Tg, le maintien du nombre de cellules Tg P14 et la disparition rapide des cellules Tg a-HY. En revanche, lorsque les cellules Tg a-HY sont transférées seules, le nombre de cellules du donneur persiste. Ces résultats montrent que la survie et la persistance de cellules T CD8 peuvent être modifiées en présence de cellules compétitrices. Ils démontrent le rôle des phénomènes de compétition dans la sélection des répertoires T périphériques. Nous avons préparé des souris TcR monoclonales (sur fond génétique B6.Rag2 -/-) pour le Tg aHY et le Tg aLCMV P14. Ces souris ne pouvant pas recombiner leurs gènes endogènes du TcR (Rag2 déficientes), les seuls lymphocytes matures trouvés dans ces animaux sont du type CD8+. L’utilisation de cellules de ces souris dans les chimères mixtes confirme l’existence des mécanismes de compétition lymphocytaire CD8. La sélection préférentielle des cellules P14 que nous avons pu observer n’est pas donc due à la possible expression d’autres chaînes endogènes. Par ailleurs, nous avons constaté que les cellules CD8 Tg aHY et P14 diffèrent non seulement par le niveau d’expression de CD44 mais aussi de CD62L. L’expression de récepteurs de migration lymphocytaire peut donc influencer les mécanismes de compétition cellulaire. Nous avons développé aussi des souris double-transgéniques (DbTg) pour l’expression de deux récepteurs des cellules T (TcR) restreints à la même molécule de classe I du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). Ces deux TcR sont spécifiques respectivement de l’antigène mâle (TcR aHY) et d’un épitope du virus LCMV (TcR P14). Chez les souris DbTg femelles, 80% des cellules CD8 périphériques expriment à leur surface les deux TcR transgéniques. Il nous faut par co-modulation étudier la hiérarchie d’association entre les différentes chaînes a et b des deux TcR Tgs. Les résultats préliminaires suggèrent une fidélité absolue d’association entre les chaînes a et b de chaque Tg. Par rapport aux souris monoclonales n’exprimant qu’un TcR (aHY ou P14), les cellules T DbTg possèdent un comportement intermédiaire lors des mises en compétition lymphocytaire. Ces résultats nous amènent à conclure que la densité du TcR peut modifier sa capacité compétitive. Chez ces souris mâles DbTg en fond Rag2-/-, nous avons étudié la sélection des lymphocytes CD8 en présence de l’antigène. Chez ces souris mâles, on détecte des populations périphériques de cellules T CD8+ qui expriment une intensité du TcR aHY (T3.70+) réduite. Nous avons conclu que la co-expression d’un deuxième TcR permet l’échappement des cellules T auto-réactives aux mécanismes de délétion intra thymique. Il nous reste à étudier l’état fonctionnel de ces cellules. Nous avons étudié le compétition cellulaire parmi les cellules T de souris déficientes pour la molécule CD28. Nous n’avons constaté aucune déficience de comportement des cellules T CD28-/- au niveau des différentes étapes de différentiation thymique, de colonisation de la périphérie. Cependant, dans les chimères mixtes CD28+ et CD28-/-, la majorité des cellules CD4+CD25+ provient des précurseurs CD28+. Ces résultats confirment la moindre efficacité d’activation des cellules déficientes en CD28. Ils montrent aussi que l’absence d’une population cellulaire est rapidement compensée par une deuxième population.
  11. Sélection périphérique T. Nous étudions la cinétique de la prolifération des lymphocytes T CD4 matures périphériques en absence de l'apport thymique. L'étude du devenir des populations de lymphocytes T transférées chez des souris déficientes en cellules T montre que le nombre final de lymphocytes récupérés après la phase de croissance exponentielle varie selon l'hôte utilisé: on obtient un nombre plus élevé de cellules chez les souris B (thymectomisées, irradiées et reconstituées avec des cellules de MO), des souris CD3e -/- ou des souris nu/nu que chez les souris complètement dépourvues de lymphocytes (Rag2-/-). Nos résultats préliminaires montrent que le taux de croissance des cellules CD4+,CD45RBhigh,CD25- "naïves" est 10 fois supérieur aux cellules CD4+,CD45RBlow,CD25+ activées. Ils suggèrent donc que l'homéostasie des cellules CD4+,CD45RBhigh,CD25- "naïves" et CD4+,CD45RBlow,CD25+ activées est réglée de façon indépendante. Nous avons trouvé après co-transfert de cellules CD4,CD25- et CD4,CD25+ que les cellules activées peuvent réduire (supprimer) la croissance de cellules naïves co-transférées. Nous avons étudié le rôle des taux d'antigène dans le devenir des populations T CD8 Tg pour le TcR a-HY. En collaboration avec Benedita Rocha (INSERM U345, CHU Necker), nous avons construit des souris chimères exprimant différentes quantités d'antigène mâle HY. Des souris femelles B6, thymectomisées et irradiées, ont été reconstituées avec 5x106 cellules de moelle osseuse. Les cellules de moelle osseuse mâle ou femelle utilisées pour cette reconstitution portaient un marqueur allotypique (allotype a ou b) qui permettait leur reconnaissance. En faisant varier la proportion de cellules de moelle osseuse mâle et femelle injectées, nous avons obtenu des souris chimères mâles/femelles dont les compartiments hématopoïétiques contenaient 90%, 50% ou 10% de cellules mâles. Ces souris ont ensuite été injectées avec des cellules T CD8+ anti-HY. Dans ces souris, nous pouvons déterminer: a) la quantité relative d'antigène ; b) le devenir des cellules T CD8 Tg ; c) la différentiation de ces cellules en lymphocytes T cytolytiques (l'élimination des cellules mâles ou la suppression de la synthèse des Igs d'allotype a). Ces expériences ont apporté des renseignements importants en ce qui concerne les mécanismes d'induction de la tolérance T ainsi que sur la persistance, la survie et les fonctions effectrices des cellules T. La persistance de l'antigène induit la tolérance immunitaire par deux mécanismes indépendants : - L'anergie (très fortes doses d'antigène) : dans les souris chimères reconstituées avec 90% de MO mâle, les cellules T Tg diminuent l'expression de leur TcR et de CD8. Les cellules T Tg persistent sans acquérir des fonctions effectrices et sont anergiques (non-répondeuses à l'antigène). - L'exhaustion (concentrations inférieures d'antigène) : dans les souris injectées avec 50% de MO de mâle, les cellules T Tg éliminent la plus grande partie des cellules mâles, mais sont incapables de les éliminer complètement et disparaissent. Ces souris sont tolérantes à l'antigène (ne répondent plus in vitro) du fait d'un épuisement de la réponse immunitaire. Dans les souris reconstituées avec 10% de MO mâle, le transfert de cellules T Tg induit la disparition complète des cellules mâles (étudié par PCR du gène Zyg spécifique du chromosome Y). Les cellules T prolifèrent et expriment toutes le marqueur CD44. Après élimination des cellules mâles, le nombre de cellules T est maintenu constant en absence (apparente) de l'antigène. La survie des cellules T mémoire parait indépendante de la présence d'antigène.
  12. Mémoire T. La stimulation du système immunitaire par un antigène (Ag) peut modifier considérablement la façon dont il répondra à cet Ag lors d'une stimulation ultérieure. Si son efficacité est augmentée, on dira qu’une réponse mémoire a été générée. Les bases cellulaires de la réponse mémoire T sont encore mal connues. La réponse mémoire peut être une conséquence d'un accroissement du nombre de cellules T spécifiques de l’Ag (induites pendant la stimulation primaire) ou dépendre des propriétés biologiques particulières des cellules T mémoire, mais ces modifications possibles de fonction restent encore à caractériser. Les mécanismes responsables de la persistance des cellules T mémoire sont aussi sujet à débat. La mémoire peut dépendre d'une stimulation antigénique continuelle, ou le maintien des cellules mémoire peut être conditionné par d'autres types d'interactions, plus particulièrement par la stimulation par des peptides à réactivité croisée . Les interactions entre cellules T et d'autres cellules sans détection de l'Ag sont nécessaires pour que les cellules T reçoivent des signaux de survie ou de direction de migration (homing). Pour répondre à ces questions nous avons, en collaboration avec Benedita Rocha, comparé les propriétés et les interactions nécessaires à la survie et à l'expansion des cellules naïves et mémoire. Dans ces études, nous avons utilisé des souris monoclonales TcR Tg (fond génétique B6.Rag2 -/-). Nous avons croisé des souris TcR-Tg portant un récepteur spécifique de l'Ag mâle, avec des souris Rag2 -/-: grâce à leur incapacité de réarranger leur récepteurs T endogènes, ces souris contiennent exclusivement des cellules T Tg, i.e., sont monoclonales. Les cellules naïves sont obtenues chez les souris femelles Tg Rag2 -/-. Les cellules mémoire sont récupérées chez des souris chimères mâle/femelle (souris Rag2 -/- reconstituées avec MO de souris déficientes en cellules T CD3 -/- 10% mâles/90% femelles). Pour l’obtention de ces cellules mémoire, nous avons stimulé les cellules naïves in vivo par l'Ag mâle en les transférant à des souris chimères mâle/femelle. Ces chimères sont obtenues en reconstituant des souris Rag 2 -/- (dépourvues de cellules T et B) avec de la moelle osseuse (MO) de souris CD3eKO, qui ne génèrent que des cellules B. Ses souris sont donc dépourvues de toute cellule T endogène. Nous avons greffé 90% de MO femelle Ly 5.1 et 10% de MO mâles Ly 5.2. Nous pouvons suivre l'Ag in vivo par un marquage de surface des cellules mâles avec un anticorps anti-Ly 5.2. Après reconstitution, 10% des cellules B périphériques de ses chimères sont des cellules mâles Ly 5.2. Les cellules MoTg transférées dans un deuxième temps à ces souris sont activées, prolifèrent et éliminent des cellules Ly 5.1 mâles, générant des cellules mémoire. Dans ce système expérimental, nous pouvons suivre le devenir des cellules T Tg transférées ainsi que leur différenciation en cellules effectrices (capacité d'éliminer les cellules mâles in vivo). Dans la mesure où ces chimères sont totalement dépourvues de cellules T endogènes et ne reçoivent qu'un seul clone de cellules T Tg par voie veineuse, les seules cellules T présentes sont issues de ce clone. Par la simple déplétion des cellules B et macrophages des organes lymphoïdes périphériques de ces souris, il nous est donc possible de récupérer un nombre élevé de lymphocytes T mémoire de nos souris chimères. En utilisant ce système, nous avons pu vérifier que la stimulation transitoire d'un clone T avec l’Ag spécifique induisait des modifications permanentes des cellules T, générant une cellule T mémoire complètement différente d'une cellule T naïve. Les cellules naïves diffèrent des cellules mémoire par l'expression du marqueur CD44, par l'expression des cytokines et de molécules impliquées dans la fonction cytolytique (FasL et perforine). Une fraction assez importante des cellules mémoire est en cycle cellulaire et incorpore du BrdU. Les cellules naïves et mémoire diffèrent également dans la nature des interactions nécessaires à leur survie ou leur expansion. En collaboration avec Mme B. Rocha et le groupe de François Lemonnier de l'Institut Pasteur, nous avons étudié ces interactions après transfert de cellules naïves ou mémoire dans des hôtes différents dans leur présentation de l'antigène et dans l'expression des molécules du CMH (en utilisant des souris mutantes ko pour les gènes de CMH classe I - H2Db et H2Kb). Nous avons montré que les cellules naïves ont besoin d'interactions avec l'antigène pour se diviser et de reconnaître l'élément de restriction du CMH (dans le cas de ce Tg - H-2Db) pour survivre à la périphérie (elles disparaissent chez les hôtes H-2Db ko). Donc, les interactions décrites comme nécessaires à la sélection positive dans le thymus sont aussi importantes pour la survie des cellules T naïves à la périphérie. Les cellules mémoire se divisent en absence de l'antigène, survivent en absence de l'élément de restriction, mais disparaissent en l'absence totale de CMH Class I (après transfert chez des hôtes H-2Dbxb2-microglobuline double ko). Elles ont donc besoin d'interactions via leur TcR pour survivre. Ces résultats suggèrent que les cellules mémoire ont un seuil d'activation plus bas que les cellules naïves; ceci permet leur activation ou leur survie en absence d'antigène par des interactions croisées avec des peptides présentés par des molécules de classe I autres que H2Db. Plus récemment, nous avons suivi le devenir de cellules monoclonales T CD8 P14 chez des souris double ko (CD3e-/- et H2Db ou H2Kb) et nous avons confirmé que ces cellules naïves ont aussi besoin de reconnaître l'élément de restriction du CMH (dans le cas de ce Tg - H-2Db) pour survivre à la périphérie.

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Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Marie Christine Vougny
poste 8593

Chercheurs de l'unité

Freitas, Antonio A.

Stagiaires de l'unité

Fabien AGENES - post. doc.
Maria Manuela ROSADO - étudiante en thèse Afonso Almeida - étudiant en thèse
Nicolas Legrand - étudiant en thèse

Autre personnel de l'unité

Marie-Pierre Lembezat Mailhé - technicienne sup.

Publications de l'unité

1       Chies, J.A.B., Marodon, G., Joret, A.-M., Regnault, A., Lembezat, M.-P, Rocha, B. & Freitas, A.A.
        Persistence of Vb6+ T cells in Mls-1amice. A role for the third complementarity-determining region (CDR3) of the T cell receptor b chain in superantigen recognition.
        J. Immunol. 155: 4171-4178 (1995)

2       Rocha, B., Grandien, A. & Freitas, A.A.
        Anergy and exhaustion are independent mechanisms of peripheral T cell tolerance.
        J. Exp. Med. 181: 993-1003 (1995)

3       Freitas, A.A., Rosado, M.M., Viale, A.-C. & Grandien, A.
        The role of cellular competition in B cell survival and selection of B cell repertoires.
        Eur. J. Immunol. 25: 1729-1738 (1995)

4       Freitas, A.A.
        Lymphocytes in a model ecosystem.
        Res. Immunol. 146: 255-233 (1995)

5       McLean, A.R.
        Vaccination, evolution and changes in the efficacy of vaccines: a theoretical framework.
        Proc. R. Soc. Lond. B. 261: 389-393 (1995)

6       McLean, A.R. & Blower, S.M.
        Modelling HIV vaccination.
        Trends in Microbiol. 3: 458-463 (1995)

7       Jungmann, P., Freitas, A., Bandeira, A., Nobrega, A., Coutinho, A., Marcos, M.-A. & Minoprio, P.
        Murine acariasis. II. Immunological dysfunction and evidence for chronic activation of Th-2 lymphocytes.
        Scand. J. Immunol. 43: 604-612 (1996)

8       Freitas, A.A., Agenes, F. & Coutinho, G.C.
        Cellular competition modulates survival and selection of CD8+ T cells.
        Eur. J. Immunol. 26: 2640-2649 (1996)

9       McLean, A.R., Rosado, M.M., Agenes, F., Vasconcellos, R. & Freitas, A.A.
        Resource competition as a mechanism for B cell homeostasis.
        Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 5792-5797 (1997)

10      Tanchot, C., Lemonnier, F.A., Pérarnau, B., Freitas, A.A. & Rocha, B.
        Differential requirements for survival and proliferation of CD8 naïve or memory T cells.
        Science 276: 2057-2062 (1997)

11      Freitas, A.A. & Rocha, B.
        Lymphocyte survival: a red queen hypothesis.
        Science 277: 277 (1997)

12      Feinberg, M.B. & McLean A.R.
        AIDS: decline and fall of immune surveillance?
        Curr. Biol. 7: R136-R140 (1997)

13      Tanchot, C., Rosado, M.M., Agenes, F., Freitas, A.A. & Rocha, B.
        Lymphocyte homeostasis.
        Sem. in Immunol. 9: 331-337 (1997)

14      Agenes, F., Rosado, M.M. & Freitas, A.A.
        Independent homeostatic regulation of B cell compartments.
        Eur. J. Immunol. 27: 1801-1807 (1997)

15      Rosado, M.M. & Freitas, A.A.
        The role of the B cell receptor V region in peripheral B cell survival.
        Eur. J. Immunol. 28: 2685-2693 (1998)

16      McLean A.R.
        Mathematical modelling of effectiveness.
        In: Preclinical and clinical development of new vaccines. Plotkin S., Brown F. & Horaud F. (eds). Dev. Biol. Stand. Basel, Karger. 95: 225-233 (1998)

17      McLean A.R.
        Development and use of vaccines against evolving pathogens: vaccine design.
        In: Evolution in health and disease. S. Stearns (eds). Oxford University Press: 138-151 (1998)

18      Bangham, C., Anderson, R., Baquero, F., Bax, R., Hastings, I., Koella, J., Lipsitch, M., McLean, A., Smith, T., Taddei, F. & Levin, B.
        Evolution of infectious diseases: the impact of vaccines, drugs, and social factors.
        In: Evolution in health and disease. S. Stearns (eds). Oxford University Press: 152-160 (1998)

19      Agenes, F. & Freitas, A.A.
        Transfer of small resting B cells into immunodeficient hosts results in the selection of a self-renewing activated B cell population.
        J. Exp. Med. 189: 319-329 (1999)

20      Freitas, A.A. & Rocha, B.
        Peripheral T cell survival.
        Curr. Opin. Immunol. 11: 152-156 (1999)

21      Freitas, A.A.
        Populationsbiologie der B-lymphozyten.
        Aspekte 11:20 (1999)

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