Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Développement des Lymphocytes

CNRS URA 1961


Responsable : CUMANO Ana (cumano@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Les lymphocytes sont constamment générées à partir des cellules hématopoïétiques souches (CHSs). Nos objectifs sont: 1. L’isolement d’une population homogène de CHSs et la caractérisation des mécanismes de détermination de lignée au cours du processus de différenciation en lymphocytes T. 2. L’identification des ligands spécifiques reconnus par les lymphocytes Tgd 3. La régulation du nombre total de lymphocytes T du système immunitaire périphérique et l’origine des populations lymphocytaires régulatrices des processus de rejet de greffe.

Abstract

Lymphocytes are constantly generated from hemopoietic stem cells. Our aims are: 1. The purification of stem cells and the characterisation of lineage commitment during T cell generation. 2. The identification of ligands for gd T cells. 3. The study of mechanisms underlying the regulation of numbers of T cells in the periphery and the origin of lymphocytes regulating graft rejection.

Texte du rapport

Développement hématopoietique chez l’embryon de souris. Responsable A. Cumano.

        Les cellules sanguines sont constamment générées, dans les organes hématopoïétiques, à partir d'un type cellulaire appelé cellule hématopoïétique souche (CHS) qui est multipotent, capable de se différencier en erythrocytes, cellules myéloïdes et lymphoïdes et qui a la capacité d'auto renouvellement. Les CHSs se trouvent dans la moelle osseuse chez la souris adulte et dans le foie foetal, chez l'embryon. Ces organes présentent, néanmoins, une complexité cellulaire très grande et, en conséquence, la fréquence des CHSs est de l'ordre de 10-5.
        Nos objectifs sont:
        1. L’isolement d’une population homogène de CHSs à partir du local où elles sont générées, pendant le développement embryonnaire, et leur caractérisation. Les CHS d’origine embryonnaire sont en division cellulaire. Nous nous proposons d’utiliser cette propriété pour tester leur capacité d’être infectées par des vecteurs retroviraux et ainsi établir un système de transfère de gènes.
        2. La compréhension des mécanismes de détermination de lignée que les Chas subissent au cours du processus de différenciation en lymphocytes T. Pour cela nous cherchons à identifier, purifier et caractériser les précurseurs de lymphocytes T qui migrent du foie foetal au thymus. Cette population cellulaire constitue les précurseurs immédiats des thymocytes, capables de reconstituer le compartiment cellulaire T d’un individu.
        Cet étude ouvre la possibilité de manipuler une population homogène de CHS et des précurseurs éventuellement déterminés dans la voie de différenciation lymphocytaire T. La capacité de contrôler le devenir de ces précurseurs, aura des implications importantes dans les situations pathologiques où la greffe de cellules hématopoïétiques est la thérapie de choix. Cette thérapie est importante dans le traitement des immunodéficiences, dont le SIDA.

        Les CHS d’origine embryonnaire et leurs progéniteurs déterminés sont en division cellulaire active, ce qui leur confère la capacité d’être infectées par des vecteurs rétroviraux. Cette caractéristique présente donc un avantage par rapport aux CHSs de la moelle osseuse adulte qui sont plutôt au repos. Ces cellules deviendront alors un outil précieux une fois administrés aux patients: 1) comme source de cellules capables de reconstituer le système hématopoïétique en général ou exclusivement de précurseurs de lymphocytes T. Les CHSs d’origine embryonnaire constituent une source enrichie de cellules immuno-incompétentes qui vont mûrir dans le nouvel organisme, sans les dangers de réaction de greffe contre l'hôte.
        Nous avons analysé l’évolution du potentiel hématopoïétique (différenciation et renouvellement à long terme) des cellules présentes dans le sac vitellin (SV) et dans la splanchnopleure-paraaortique (Sp-PA) d'embryons de souris entre le jour 7 et 12.5 de gestation.
        Nous avons détecté des cellules hématopoïétiques multipotentes dans la Sp-PA et dans le sac vitellin à partir du moment où la circulation est établie (i.e. au stade de 10 somites). Avant ce stade, les précurseurs multipotents sont absents du sac vitellin, ce qui indique que la première et unique source de cellules hématopoïétiques multipotentes est bien dans le corps embryonnaire. Notre observation donne un intérêt primordial à cette région du corps embryonnaire. Des expériences de dilution limite ont montré que ces précurseurs multipotents augmentent en nombre, avec le stade de développement de l'embryon alors que nous n’observons aucune activité de différenciation. Cette activité de génération de cellules souches atteint un niveau maximal au 10.5ème jour de gestation puis décroît rapidement pour s’éteindre vers le 12.5ème de gestation (6).
         Les CHSs fondatrices de l’hématopoïèse définitive sont donc originaires du mésoderme intraembryonnaire. Les CHSs arrivent au foie fœtal entre le 10ème et le 11ème jour de la gestation et au thymus vers le 11ème jour de la gestation. En effet, nous avons montré qu’un nombre croissant de cellules multipotentes, capables de reconstituer un animal irradié est présent en circulation entre le 10ème et le 13ème jour de la gestation. Ces résultats nous ont permis de formuler l’hypothèse que tous les organes hématopoïétiques actifs pendant la vie embryonnaire (foie, thymus et rate) ainsi que les ébauches de moelle osseuse (le principal site de hématopoïèse, chez l’adulte) sont colonisés entre le 10ème et le 13ème jour de gestation par la même vague de cellules souches provenant du mésoderme paraaortique (4 et manuscrit en préparation).
        La première vague de cellules hématopoïétiques qui arrivent dans le thymus vers le 11ème jour de gestation semble être constituée de cellules venues de la région paraaortique. Cependant, le thymus reçoit un apport constant de précurseurs qui doivent migrer du foie foetal, après extinction de la région paraaortique comme source de cellules souches. Dans le but d’une identification ultérieure des précurseurs des thymocytes dans le foie foetal, nous avons déterminé le nombre de précurseurs de cellules T dans le thymus embryonnaire et dans le foie. Avec des outils d'analyse unicellulaire dans des systèmes de culture qui permettent la détermination de la fréquence des précurseurs de cellules T, nous avons montré que le nombre de ces précurseurs dans le thymus, augment environ 150 fois, entre le 12ème et le 14ème jour de gestation (8). Le nombre de précurseurs de lymphocytes T augmente à partir du 11ème jusqu’au 13ème jour de la gestation, dans le foie foetal. A partir de ce jour, ce nombre diminue. Cette réduction est concomitante à une augmentation du nombre de précurseurs T dans le thymus embryonnaire dont l’ampleur ne peut pas être expliquée par simple division cellulaire in situ. Nous avons ainsi calculé que le nombre de précurseurs de lymphocytes T qui rentrent dans le thymus est de 20 entre jours 11 et 12, de 300 entre jour 12 et 13 et de 3000 entre jour 13 et 14 de gestation. L’étude des caractéristiques des cellules de ses différentes vagues de colonisation thymique ont indiqué que les immigrants qui rentre dans le thymus entre le 12ème et le 13ème jour de la gestation sont des cellules déterminées dans la voie T de différenciation.
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Biologie du Développement des lymphocytes T gd. Responsable P. Pereira.
        La recherche que nous menons depuis quelques années porte sur différents aspects de la physiologie des lymphocytes Tgd. Notre travail est centré sur deux questions majeures concernant cet ensemble lymphocytaire: 1) Quels sont les ligands spécifiques reconnus par les cellules Tgd et 2) Quelles sont les étapes de différentiation et de sélection suivies par les cellules Tgd dans leur développement?
        En ce qui concerne la caractérisation de leurs ligands spécifiques, nous avons poursuivi l'identification des gènes qui contrôlent la représentation des différentes sous-populations de cellules Tgd dans l'intestin de souris. Nous nous sommes intéresses tout particulièrement à la localisation d'un gène lié au Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH). A ce jour, nous avons produit et analysé quatorze souris recombinantes dans le CMH, ce qui nous a permis de localiser ce gène dans l'intervalle H2K-H2D du CMH et, plus précisément, entre le gène H2K et celui codant pour le Tnf.
        Nous avons aussi continué la caractérisation d'une sous-population de cellules Tgd que nous avions découverte il y a quelques années. Les cellules appartenant à cette sous-population présentent deux caractéristiques particulières. Elles sont capables de produire des cytokines du type Th2 (ex. IL 4 et IL 10) et expriment un répertoire TCR très restreint. Cette année, nous avons pu montrer que l'homogénéïté de ce répertoire TCR est due, principalement, à une sélection positive des cellules exprimant ce TCR. Nous avons aussi cloné les gènes réarrangés g et d exprimés par un hybridome T appartenant à cette population et injecté ces clones dans des oeufs fécondés afin d'obtenir des souris transgéniques exprimant ce récepteur. Nous avons déjà obtenu des souris portant dans leur ADN soit les deux gènes g et d réarrangés, soit uniquement l'un de ces 2 gènes. Bientôt, nous serons en mesure d'analyser l'expression fonctionnelle de ces gènes. Ces souris devraient être de grande utilité dans les études de la sélection et la fonction de cette sous-population Tgd.
        Par ailleurs, nous avons réalisé une analyse systématique des gènes influençant la représentation de cette population dans le thymus. Nos résultats ont montré un rôle prépondérant de deux régions génomiques localisées dans les chromosomes 13 et 17.
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Développement du processus de tolérance. Responsable A. Bandeira
        Nos projets portent sur trois thèmes: 1. Tolérance dominante induite par un épithélium thymique allogénique: ontogénie et physiologie des cellules T régulatrices; 2. La régulation du nombre total de lymphocytes T du système immunitaire périphérique; l’origine et physiologie des populations lymphocitaires régulatrices naturellement activées; lien entre les cellules régulatrices qui maintiennent la tolérance aux composants du soi et celles qui régulent les réponses immunitaires au niveau des muqueuses; 4. Rejets de tissues embryonnaires.
  1. Tolérance induite par l’épithélium thymique allogénique: ontogénie et physiologie des cellules T régulatrices.
        L'ensemble de nos travaux expérimentaux dans le domaine de la tolérance induite par un épithélium thymique (ET) allogénique nous a conduit à établir deux principes majeurs concernant d’une part, le processus de sélection thymique et, d’autre part, l'ontogénèse de la tolérance périphérique.
        Nous avons démontré que la tolérance induite par l’ET se fait sans que des lymphocytes T spécifiques de l'haplotype du CMH de l'ET ne soient délétés, et que des cellules T suppressives/régulatrices sélectionnées exclusivement par l'ET, étaient impliquées dans la tolérance vis-à-vis de plusieurs tissus périphériques.
        Ces observations ont ainsi établi un lien entre sélection positive intrathymique et tolérance périphérique car elles impliquent, dans le processus d'induction de tolérance thymique (centrale), des mécanismes de tolérance "dominante" jusqu'alors uniquement considérés dans l'établissement de la tolérance périphérique.
        La découverte de cellules T régulatrices sélectionnées par l'ET permet non seulement une nouvelle compréhension de la sélection positive des répertoires de cellules T dans le thymus, car elle implique des interactions TCR/ligand de haute affinité, mais procure aussi les bases pour analyser les stratégies suivies par l’ET dans l'induction de la tolérance aux antigènes non présents dans le thymus.
        Ces principes ont permis de définir un modèle théorique capable d'expliquer l'établissement, au cours du développement, de la tolérance aux antigènes du soi exprimés dans le thymus ou bien exclusifs d’un tissu périphérique, ainsi que son maintien chez l'adulte. Ce modèle repose sur des concepts de tolérance "dominante" à la périphérie (impliquant des mécanismes actifs de régulation) et invoque (i) l'origine et la sélection intra-thymique des premières cellules T autoréactives régulatrices; (ii) une dynamique de populations caractéristique de l'établissement des répertoires pour générer la « connaissance » du soi antigénique au cours du développement et en maintenir une mémoire dynamique pour la vie.
        Considérant la tolérance centrale et périphérique comme le résultat de programmes développementaux, les études à entreprendre ont pour but de caractériser la composition cellulaire hétérogène (et variable) du stroma thymique, les règles d'activation des précurseurs et des lymphocytes T et la régulation des fonctions effectrices par le micro-environnement, ainsi que la dynamique des populations
        Nos études actuels développent les thèmes suivants: (1) l’ontogénie de génération de cellules T régulatrices; (2) l’identification et l’isolement des cellules T régulatrices sélectionées dans le thymus; (3) l’étude des mécanismes de suppression et d’éducation des cellules T non-tolérantes par les cellules T régulatrices.

2. Régulation du nombre des lymphocytes: Etude de la dynamique des populations lymphocytaires CD4 naives et naturellement activées dans le cadre de la maladie inflammatoire de l’intestin.

        Les tissus et organes des organismes multicellulaires sont sous la régulation stricte de nombre de cellules totales. Une des questions clé toujours à l’étude dans la physiologie du système immunitaire est de savoir comment opèrent les mécanismes homéostatiques qui contrôlent le nombre des lymphocytes. Plusieurs maladies autoimmunes ont été associées à des immunodéficiences caractérisées par une lymphopénie.
        Nous pensons que l’état naturel de tolérance aux antigènes spécifiques au tissus est basé sur l’existence de mécanismes régulateurs qui préviennent la différenciation et la prolifération incontrôlée des clones de cellules T agressives et réactives au soi. Nous suggérons que des cas de lymphopénie peuvent provoquer la disparition des circuits dépendants des cellules T régulatrices qui contrôlent normalement les cellules T auto-réactives. Dans cette perspective les maladies autoimmunes doivent être considérées comme des formes d’immunodéficience.
        Des modèles murins pour une maladie humaine appelée colite ulcérative, une forme de maladie inflammatoire des intestins (IBD) ont aussi montré le rôle des mécanismes de contrôle des cellules T qui régulent les réponses immunitaires développées par des lymphocytes T naifs dans la muqueuse de l’intestin contre les antigènes de la flore intestinale ou de la nourriture. Une dé-régulation de ce processus conduit à la maladie et mort de l’animal.
        Nous voulons savoir si les mécanismes régulateurs qui contrôlent en général le nombre de lymphocyte T périphériques sont les mêmes qui régulent la tolérance périphérique aux antigènes du soi ainsi que les réponses immunes au niveau des muqueuses.
        L'ensemble de nos études actuels se centrent sur 1) la quantification du potentiel de expansion in vivo des cellules CD4 naturellements activées et celui des populations CD4 naives; 2) le devenir des populations de cellules T naives (potentiellement agressives) en présence de cellules T régulatrices dans des expériences de co-transfert; et 3) identification et isolement des cellules T régulatrices naturelles dans le thymus et à la périphérie.

3. L’Epithélium thymique (ET) est-il un tissu susceptible d’être rejeté par un système immunitaire adulte?

Etant donné les charactéristiques uniques de l’ET dans l’induction de tolérance, nous avons greffé des ébauches embryonnaires d’ET avant toute colonisation par des cellules hématopoiétiques (CH) chez des souris adultes allogéniques. L’étude d’un nombre considérables d’animaux a démontré que l’ET est rapidemment détruit. Ceci s’est avéré être aussi le cas pour des greffes de coeur d’embryon de jour 8. A ce jour l’établissement de la circulation ne s’est pas encore fait ce qui implique l’absence dans les tissus de cellules d’origine hématopoiétique (HC) présentatrices d’antigen. Le concept jusqu’ici considéré est de que les tissues déplétés de ce type de cellules ne sont pas rejetés. Ce concept s’est basé sur les résultats obtenus dans plusieurs systèmes expérimentaux de tolérisation induite par des traitements chimiques ou physiques de différents types de tissus. Nos résultats ne sont donc pas compatible avec ce concept et impliquent outre que la dépletion de CH, des effets tolérisants directes de ces traitements.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

Marie-Christine VOUGNY
Poste 8593

Chercheurs de l'unité

Antonio BANDEIRA, CR1 CNRS
Ana CUMANO, DR2 Inserm
Pablo PEREIRA, CR Institut Pasteur

Stagiaires de l'unité

Isabelle ANDRE, Post-Doc
Oliver ANNACKER, étudiant thèse
Ricardo ARAUJO, étudiant thèse
Vasco BARRETO, étudiant thèse
Déborah BRAUN, étudiante thèse
Jocelyne DEMENGEOT, Post-Doc
Iyadh DOUAGI, étudiant thèse
Kalliopi GRIGORIADOU, étudiante thèse

Autre personnel de l'unité

Laurent BOUCONTET, Technicien Supérieur de Laboratoire Odile BURLEN-DEFRANOUX, Ingénieur

Publications de l'unité

  1. S. Delassus, S. Darche, P. Kourilsky and A. Cumano. Ontogeny of the heavy-chain immunoglobulin repertoire. 1998.
  2. Immunol., 160: 3274-3280.
  3. H. Ema, I. Douagi, A. Cumano and P. Kourilsky. Development of T-cell precursors in the murine fetal liver. 1998. Eur. J. Immunol. 28: 1563-1569.
  4. F. Nourrit, N. Doyen, F. Rougeon, P. Kourilsky and A. Cumano. Diverse immunoglobulin repertoire expressed by the progeny of single multipotent precursors in the absence of selection. 1998.
  5. Immunol. 160:4254-4261.
  6. H. Neubauer, A. Cumano, M. Müller, H. Wu, U. Huffstadt and K. Pfeffer. Jak2 deficiency defines an essential developmental checkpoint in definitive hematopoiesis. 1998. Cell. 93: 397-409.
  7. M. W. Schilham, A. Wilson, P. Moerer, B. J. Benaissa-Trouw, A. Cumano and H. C. Clevers. Expansion of thymocytes but not of mature T lymphocytes is dependent on Tcf-1. 1998.
  8. Immunol.161: 3984-3991.
  9. I. Godin, J. A. Garcia-Porrero, F. Dieterlen-Lièvre and A. Cumano. Stem Cell Emergence and Hemopoietic Activity are Incompatible in Mouse Intraembryonic Sites. 1999.
  10. Exp. Med. sous presse.
  11. V. Barreto and A. Cumano. Frequency and characterization of phenotypic immunoglobulin heavy-chain allelic included IgM-expressing B cells in normal mice. 1999. Soumis.
  12. I. Douagi, I. André, C. Ferraz and A. Cumano. Dynamic of T-cell precursor activity in the murine fetal thymus. 1999. Soumis.
  13. F. Dieterlen-Lièvre and A. Cumano. Ontogeny and phylogeny of commitment and differentiation in the hematopoietic and immune system. Editorial. 1998. Developmental and Comparative Immunology. 22: 249-252.
  14. A. Cumano, I. Godin, S. Delassus, F. Dieterlen-Lièvre and V. Barreto. Changes in Lymphoid Progenitor Populations During Mammalian Development. 1999. In Hemopoietic Development. Sous presse.
  15. Zuany-Amorin, C., Ruffié, C., Hailé, S., Vargaftig, B.B., Pereira, P. & Pretolani, M.

    Requirement for gd T cells in allergic airway inflammation Science 280: 1265-1267,1998

  16. Azuara, V., Lembezat, M.P. & Pereira, P.

    The homogeneity of the TCRd repertoire expressed by the Thy-1dull gd T cell population is due to cellular selection Eur. J. Immunol. 28:3456-3467, 1998

  17. Azuara, V. & Pereira, P.

    Genetic mapping of two loci that control the development of IL-4 producing Thy-1dull gd thymocytes. Soumis.

  18. Gerber, D.J., Azuara, V., Levraud, J.P., Ying Huang, S., Lembezat, M.P. & Pereira, P.,

    IL-4 producing gd T cells that express a very restricted TCR repertoire are preferentially localized in the liver and in the spleen. Soumis.


  19. Cederbom,L., A. Bandeira, A. Coutinho and F. Ivars.

    Naturally activated CD4+ T cells are highly enriched for cytokine producing cells. Eur. J. Immunol., 28: 1934-1940 (1998).

  20. A. Bandeira.

    Thymic epithelium: Potential role in regulatory T cell tolerance. Encyclopedia of Immunology, Second Edition, Academic Press (1998), 2292-2299.

  21. Annacker, O. Burlel-Defranoux, R. Araujo, A. Cumano and A. Bandeira.

    Naturally activated CD4 T cells regulate the size of the peripheral naive CD4 T cell pool. Soumis.

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