Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Biochimie Structurale


Responsable : ALZARI, Pedro M. (alzari@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L'Unité de Biochimie Structurale est orienté à l'étude de la structure tridimensionnelle de protéines et la spécificité des interactions protéine-ligands par les moyens de la cristallographie des rayons-X, la biochimie des protéines, la microcalorimétrie et la modélisation moléculaire. Les thèmes de recherche de l'Unité comprennent l'analyse structurale des oxydoréductases et des kinases de M. tuberculosis, des sialidases de T. cruzi, des déoxynucléotidyl transférases et des glycosidases bactériennes.

Abstract

The research activities of the Unit of Structural Biochemistry are oriented towards the study of the three-dimensional structure and ligand-binding specificity of proteins by X-ray crystallography, protein biochemistry, microcalorimetry and molecular modelling techniques. The major themes of research involve structural studies of mycobacterial reductases and kinases, trypanosomal sialidases, deoxynucleotidyl transferases and bacterial glycosidases.

Texte du rapport

Trans-sialidases de Trypanosoma cruzi (P.M. Alzari)

Les protozoaires flagellés Trypanosoma cruzi, l'agent causal de la maladie de Chagas dans le continent américain, et T. brucei, l'agent de la maladie du sommeil en Afrique, expriment une trans-sialidase de surface capable de catalyser le transfert d'acide sialique entre différentes glycoprotéines. L'expression de cette enzyme chez T. cruzi est directement liée au pouvoir d'infection du parasite. Nous avons entamé l'analyse structurale des enzymes homologues de trypanosomatides pathogènes (trans-sialidase de T. cruzi) et non-pathogènes (sialidase de T. rangeli) afin de comprendre les bases moléculaires de l'activité de transglycosylation (synthèse de polysaccharides) et de permettre la conception rationnelle d'inhibiteurs pouvant servir à des fins thérapeutiques.

Oxydoréductases et protéines kinases de Mycobacterium tuberculosis (P.M. Alzari)

Nos études visent à élucider la structure tridimensionnelle d'enzymes mycobactériennes associées à la pathogénicité et à la virulence de M. tuberculosis, afin de comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents et de contribuer au développement des nouveaux outils thérapeutiques. En collaboration avec l'Unité de Génétique Moléculaire Bactérienne, nous poursuivons l'analyse structurale des protéines kinases mycobactériennes impliquées dans la transduction des signaux et d'oxydoréductases (comme la catalase-peroxydase KatG et l'alkyl hydroperoxyde réductase AhpC) impliquées dans les mécanismes de résistance aux antibiotiques.

Le cellulosome de Clostridium thermocellum (P.M. Alzari)

La bactérie thermophile anaérobie C. thermocellum synthétise un système enzymatique, le cellulosome, capable de dégrader la cellulose cristalline. Le cellulosome est composé de plusieurs sous-unités catalytiques (glycosidases) et non-catalytiques associées sous la forme d'un complexe muliti-protéique de haut poids moléculaire. En collaboration avec l'Unité de Physiologie Cellulaire, nous travaillons sur l'analyse structurale et fonctionnelle des différents sous-unités du complexe afin de comprendre les bases moléculaires de l'hydrolyse de polysaccharides, de la spécificité des interactions protéine-sucre et de l'assemblage macromoléculaire du cellulosome.

Etude cristallographique de la terminal désoxynucléotidyl-transférase (M. Delarue).

La terminal transferase appartient a la famille des polymerases beta (ou pol X). Elle est capable d'elonger un primer oligonucleotidique long d'au moins 4 bases, a partir des dNTP presents en solution, sans avoir besoin de matrice a recopier. On pense qu'elle est responsable in vivo de le generation de la diversité du systeme immunitaire a travers l'elongation des regions V(D)J. Le but de cette étude, en collaboration avec l'Unité de Biochimie du Développement, est de caracteriser structuralement la spécificité relativement étendue de cette enzyme vis-a-vis de nucléotides triphosphates modifiés et le role des ions metalliques dans le site actif. Des cristaux diffractant a 2.3 angstroms ont été obtenus et la resolution de la structure est en cours.

Etude cristallographique des TMP kinases bactériennes (M. Delarue)

La TMP kinase est une cible potentielle nouvelle pour le design d'antibiotiques. En collaboration avec le Laboratoire de Chimie Structurale des Macromolecules, nous avons cristallisé differentes TMP kinase bactériennes, dont l'une diffracte 1.9 Angstrom de resolution et a été résolue par remplacement isomorphe. L'étude cristallographique de différents complexes avec des inhibiteurs est en cours et permettra d'affiner la synthèse d'antibiotiques potentiels.

Cristallisation de la protéine non-structurale NSP3 de rotavirus (M. Delarue)

La proteine NSP3 de rotavirus a ete recemment caracterisee par le groupe J. Cohen a l'INRA (Jouy-en-Josas); nous cherchons a cristalliser cette proteine qui fixe l'ARN viral sur une longueur de 5 nucleotides, selon un mode qui semble encore non decrit dans la litterature des interactions proteines-acides nucleiques.

Biocalorimétrie et analyse thermodynamique (F. Schaeffer)

La station de microcalorimétrie a été installée dans l'Unité au cours de l'année 1998. Celle-ci comprend le calorimètre de titration isotherme (ITC) destiné à l'étude des associations macromoléculaires et le calorimètre à balayage des températures (DSC) destiné à l'étude des transitions conformationnelles de ces même molécules. Jointe à l'analyse structurale, l'analyse calorimétrique permet la détermination des forces et des motifs structuraux guidant l'élaboration d'une structure macromoléculaire ou la formation d'un complexe macromoléculaire. L'étude des interactions protéine-protéine a été développée dans le cadre des sujets suivants: le mécanisme d'action de l'activité anti-coagulante de la phospholipase A2 sécrétée humaine (collaboration avec l'Unité des Venins), la renaturation du cytochrome c en présence d'anticorps monoclonaux dirigés contre la forme native de la protéine (collaboration avec l'unité de Biochimie Cellulaire), l'interaction entre sous-unités catalytiques et non-catalytiques responsable de l'assemblage macromoléculaire du cellulosome (collaboration avec l'Unité de Physiologie Cellulaire). L'étude des interactions ADN-protéine a été initiée en déterminant les paramètres énergétiques de l'ADN courbe, une structure de l'ADN facilitant son association avec les protéines. Ces paramètres énergétiques ont permis d'établir la relation existante entre courbure et réactivité chimique de l'ADN dans le cas de la nucléase chimique 'orthophénanthroline-cuivre'.

Nouvelles méthodes en "sequence design", compatibilité séquence-structure. Generation de modeles de proteines par homologie ou ab initio. (M. Delarue, en coll. avec P. Koehl, Stanford University et UPR 9003 CNRS, Strasbourg)

Differentes methodes (en particulier par champ moyen et/ou Monte Carlo) sont explorees pour caracteriser les sequence susceptibles de "decorer" un type de repliement donne. L'explosion des banques de structures et de sequences tend en effet a montrer que plusieurs sequences non reliees (en tout cas de similarite indetectable par les programmes actuels de recherche de similarite de sequence) peuvent adopter le meme type de repliement dans l'espace. D'ou l'idee de developper des matrices de mutations specifiques de chaque type de repliement, afin de screener les banques de sequences rapidement. Enfin, la generation de modeles par homologie basee sur le champ moyen a ete recemment mise sur le web.
http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/homology.html http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/confmat.html Nous poursuivons ce travail en
developpant des methodes capables de generer ab initio des chaines polypeptidiques stereochimiquement correctes respectant un certain nombre de criteres energetiques et geometriques.
http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/environ.html

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

FEJT, Francoise Institut Pasteur

Chercheurs de l'unité

ALZARI, Pedro M.                Institut Pasteur
DELARUE, Marc                   CNRS
LASCOMBE, Marie-Bernard         CNRS
SCHAEFFER, Francis              Institut Pasteur

Stagiaires de l'unité

AMAYA, Maria Fernanda           Thèse
BOITEL, Brigitte                Post-Doc
BUSCHIAZZO, Alejandro           Post-Doc
COSTABEL, Marcelo               Post-Doc
GALLAY, Inés                    Post-Doc
G. GUIMARAES, Beatriz           Post-Doc
JOURDAN, Nathalie               Post-Doc
MATE PEREZ, María Jesus         Post-Doc
ORTIZ LOMBARDIA, Miguel         Post-Doc

Autre personnel de l'unité

EXPERT-BESANCON, Nicole         Institut Pasteur
NGUYEN, T. Tong                 Institut Pasteur
SOUCHON, Hélène                 CNRS
TELLO, Diana                    Institut Pasteur

Publications de l'unité

Tavares, G., Béguin, P., Alzari, P.M. (1997) The crystal structure of a type I cohesin domain at 1.7 Å resolution. J. Mol. Biol., 273, 701-713.

Babino, A., Pritsch, O., Oppezzo, P., Du Pasquier, R., Roseto, A., Osinaga, E., Alzari, P.M. (1997). Molecular cloning of a monoclonal anti-tumor antibody specific for the Tn antigen and expression of an active single-chain Fv fragment. Hybridoma, 16, 317-324.

Delarue, M., Koehl, P. (1997) The inverse protein folding problem: self-consistent mean field optimization of a structure specific mutation matrix. In Proceedings of the Pacific Symposium on Biocomputing Altman R.B., Dunker A.K., Hunter L. and Klein T., eds. World Scientific, Singapore. pp 109-121.

P. Koehl, P., Delarue, M. (1997) The native packing determines side chain packing in a protein, but does optimal packing determine the native sequence? In Proceedings of the Pacific Symposium on Biocomputing, Altman R.B., Dunker A.K., Hunter L. and Klein T., eds. World Scientific, Singapore. pp 198-209.

Guillouard, I., Alzari, P.M., Saliou, B., Cole, S.T. (1997) The carboxy-terminal C2-like domain of the a-toxin from Clostridium perfringens mediates calcium-dependent membrane recognition. Molec. Microbiol., 26, 867-876.

Demangel, C., Rouyre, S., Alzari, P.M., Nato, F., Longacre, S., Lafaye, P., Mazie, J.C. (1998) Phage-displayed mimotopes elicit monoclonal antibodies specific for a malaria vaccine candidate. Biol. Chem., 379, 65-70.

Terenzi, H., Alzari, P.M., Zakin, M.M. (1998) Structural features involved in the formation of a complex between the monomeric or the dimeric form of Rev-erb b DNA-binding domain and its DNA reactive sites. Biochem., 37, 11488-11495.

Béguin, P., Alzari, P.M. (1998). The cellulosome of Clostridium thermocellum. Biochem. Soc. Transactions, 26, 178-185.

C. Mounier, T.M. Hackeng, F. Schaeffer, G. Faure, C. Bon & J.H. Griffin (1998) Inhibition of prothrombinase by human secretory phospholipase A2 involves binding to factor Xa. J. Biol. Chem. 273, 23764-23772.

P. Koehl and M. Delarue (1998) Minimisation of protein lattice model distortions based on self-consistent mean field theory. J. Chem. Phys. 108, 9540-9549.

Susin, S.A., Lorenzo, H.K., Zamzami, N, Marzo, I, Brenner, C., Larochette, N., Prevost, M.C., Alzari, P.M., Kroemer, G. (1999) Mitochondrial release of caspases-2 and -9 during the apoptotic process. J. Exp. Med., 189, 381-393.

Mate, M.J., Zamocky, M., Nykyri, L.M., Herzog, C., Alzari, P.M., Betzel, C., Koller, F., Fita, I. (1999) Structure of catalase A from Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Biol., 286, 135-149.

Gregoire, C., Tavares, G.A., Lorenzo, H.K., Dandeu, J.P., David, B., Alzari, P.M. (1999) Crystallization and preliminary crystallographic analysis of the major horse allergen Equ c 1. Acta Crystallogr. D55, 880-882.

Saint-Joanis, B., Souchon, H., Wilming, M., Johnsson, K., Alzari, P.M., Cole, S.T. (1999) Use of site-directed mutagenesis to probe structure, function and isoniazid-activation by catalase-peroxidase, KatG, from Mycobacterium tuberculosis. Biochem. J., 338, 753-760.

Susin, S.A., Lorenzo, H.K., Zamzami, N., Marzo, I., Snow, B.E., Brothers, G.M., Mangion, J., Jacotot, E., Costantini, P., Loeffler, M., Larochette, N., Goodlett, D.R., Aebersold, R., Siderovski, D.P., Penninger, J.M., Kroemer, G. (1999) Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor. Nature, 397, 441-446.

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