Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Bactériologie Moléculaire et Médicale


Responsable : BARANTON Guy (gbaran@pasteur.fr)

Résumé du rapport

RESUME
Concernant les spirochètes, la caractérisation de gènes de Borrelia (priAB, ruvA) et de Leptospira (metX, metY),de nouvelles espèces (Borrelia bissettii, Leptospira fainei, Serpulina alvinipulli) et l'épidémiologie moléculaire forment les points forts. Chez les Yersinia, c'est la caractérisation et la diffusion de l'ilôt de haute pathogénicité tant à l'intérieur qu'à l'extérieur du genre Yersinia qui constituent les résultats majeurs.

Mots clefs: Borrelia, Leptospira, Serpulina, Yersinia, Bactériologie

Abstract

Summary

Concerning spirochaetes, the characterisation of genes from Borrelia (ruvA, priAB) and Leptospira (metX, metY), of new species (Borrelia bissettii, Leptospira fainei, Serpulina alvinipulli) and molecular epidemiology represent the strong points. For Yersinia, the major results consist in the characterisation of the pathogenicity island and its diffusion inside and outside the Yersinia genus.

Key words: Borrelia, Leptospira, Serpulina, Yersinia, Bacteriology

Texte du rapport

L'un des pôles de recherche de l'Unité est l'étude des spirochètes avec une direction fondamentale : aspects structurel et fonctionnel de leur génome, interaction des spirochètes avec leur hôte, et un domaine appliqué : taxonomie, phylogénie et diagnostic. L'autre groupe bactérien exploré est celui des Yersinia dont, là encore, la structure du génome et son degré de stabilité sont analysés. Certains facteurs ou marqueurs de virulence, dont les gènes sont regroupés en un îlot de haute pathogénicité particulièrement instable, sont étudiés. L'épidémiologie moléculaire est également un secteur d'intérêt pour les spirochètes comme pour les Yersinia.

Spirochètes :

Les spirochètes, agents de leptospirose (une anthropozoonose), borréliose de Lyme (transmise par des tiques) et autres spirochétoses sont des bactéries pathogènes à croissance lente. Ces bactéries se prêtent difficilement à l'analyse par la génétique classique car les possibilités de transfert génétique ne sont pas disponibles en routine. La démonstration de la diversité des souches américaines et européennes de B. burgdorferi, alliée aux divers symptômes (dermatologiques, neurologiques et articulaires) a conduit à l'individualisation de nouvelles espèces. L'organisation génomique particulière des spirochètes a été également approfondie: B. burgdorferi a un chromosome linéaire tandis que Leptospira interrogans possède deux chromosomes. Les études des interactions des spirochètes avec leur hôte ont été abordées très récemment.

Homologues des gènes priA et ruvAB, dans la région télomèrique gauche du chromosome linéaire de Borrelia burgdorferi

(C. Eude, I. Saint Girons)

Des gènes impliqués dans la mise en route de la réplication de l'ADN et la résolution d'intermédiaires de recombinaison (jonctions Hollyday) ont été identifiés dans une région de 23 Kpb, proche de l'extrémité gauche du chromosome linéaire de Borrelia burgdorferi. Le gène ruvB potentiel a été identifié par la similitude de sa séquence déduite en aminoacides avec les séquences d'hélicases (RuvB) d'autres bactéries. L'expression des gènes ruvB et ruvA rend une souche d'E. coli de type sauvage sensible au rayonnement ultraviolet et à la mitomycine, indiquant une complémentation négative. Les gènes ruvA et ruvB font partie d'un opéron. Un autre gène, priA, impliqué dans la réplication du primosome, a été trouvé à environ 15 kb du télomère gauche. RuvAB et PriA possèdent des motifs caractéristiques d'hélicase : boite DExH et site de fixation d'ATP.

Dispersion des gènes de biosynthèse de la méthionine sur les deux chromosomes de L. interrogans

(J. Belfaiza, P. Bourhy, B. Van den Haute, I. Saint Girons)

Nous avions montré que la première étape de la voie de biosynthèse de la méthionine chez Leptospira est catalysée par une homoserine O-acetyltransferase. La seconde étape est catalysée par une homoserine O-acetylsulfhydrylase sans étape intermédiaire via la cystathionine. Les deux gènes metX et metY correspondant sont localisés sur le grand chromosome de Leptospira. Nous avons isolé un autre gène de la voie de biosynthèse de la méthionine (metF), localisé sur le petit chromosome de Leptospira.

Leptospires et invasion cellulaire

(Fabrice Mérien)

Cette direction de travail qui, l'an dernier, avait été initiée in vitro, s'est poursuivie, toujours à Nouméa, par une étude de l'infection expérimentale du hamster après injection de Leptospira icterohaemorrhagiae, souche Verdun virulente. Cette étude a révélé que seuls les hépatocytes, parmi les différents types cellulaires des divers organes cibles, présentaient in vivo un phénomène d'apoptose.

Taxonomie des leptospires

(Philippe Perolat)

Plusieurs souches très voisines ont été isolées de prélèvements de porcs en Australie. Leur caractérisation par sérotypie, PCR, AP-PCR, électrophorèse en champ pulsé et hybridation ADN/ADN, a montré qu'il s'agissait d'un nouveau sérovar : hurstbridge, nouveau sérogroupe Hurstbridge, appartenant à une nouvelle espèce, L. fainei. Le séquençage du gène rrs montre que cette espèce appartient à un groupe intermédiaire entre les pathogènes et les saprophytes. Cependant, la présence au sein de ce groupe de contaminants laisse planer un doute sur la réalité de la pathogénicité de ce nouveau taxon.

Epidémiologie moléculaire des Borrelia

(Nuria Marti Ras, Danièle Postic)

Les outils moléculaires dont nous nous sommes dotés nous permettent de suggérer des relations privilégiées d'hôtes ou de vecteurs donnés et d'espèces de Borrelia burgdorferi sensu lato (B.b.s.l.) Par ailleurs, ils nous autorisent à effectuer des inventaires taxonomiques en fonction des zones géographiques Ce fut le cas en Europe de l'Ouest et également dans certains pays de l'Est, mais aussi aux USA ou nous avons été amenés à reconsidérer la diversité des souches atypiques, isolées notamment en Californie, où nous avons pu formaliser la description d'une nouvelle espèce, à priori non pathogène pour l'homme, B. bissettii.

Centre National de Référence des Leptospires et Centre Collaborateur OMS/FAO pour l'épidémiologie des leptospires. http://www.pasteur.fr/clre/

(Danièle Postic, Guy Baranton)

Participation au diagnostic des leptospiroses,recueil et traitement des données épidémiologiques, identification et typage des souches reçues de Metropole, des DOM/TOM et de l'étranger. Diffusion des résultats épidémiologiques. Le résumé du rapport annuel 1998 du CNR concernant la France Métropolitaine et les DOM/TOM, avec les Tableaux chiffrés est disponible sur le serveur Leptospires: http://www.pasteur.fr/Bio/Leptospira/textcnr98

(VAN Thi Bao CAO)

Cette surveillance permanente et passive est parfois renforcée notamment sur le plan international par des données de surveillance active. Ainsi en 1998, les résultats d'une enquête sérologique realisée en collaboration avec les Instituts Pasteur d'Ho Chi Minh Ville et de Nouméa ont révélé dans le delta du Mékong une incidence annuelle de la leptospirose qui pouvait atteindre 20%, en faisant un véritable problème de santé publique.

Francisella et Legionella

(Cuong Tram)

Ce laboratoire réalise des expertises pour des collectivités publiques ou privées concernant la recherche de Legionelles dans les systèmes de climatisation et d'adduction d'eau. Ces expertises comportent: isolement par culture,etidentification par anticorps monoclonaux et PCR ou hybridation. Pour les Francisella, agents de la tularémie, ce laboratoire fonctionne comme un Centre de référence: détection et isolement des Francisella dans les produits pathologiques humains et animaux. Identification par la mise en evidence des antigènes spécifiques 17 et 43 kd en western blot ou par PCR et hybridation. Les souches de ces 2 genres sont mises en collection après recherche de pénicillinase. D'autres activités de service concernent la fourniture d'antigènes au Centre Pasteur Cerba.

Yersinia

Le genre Yersinia comprend trois espèces pathogènes pour l'homme. Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica, largement répandues dans tous les pays tempérés et froids, sont responsables d'une symptomatologie digestive. Y. pestis est l'agent de la peste, maladie qui sévit sous forme endémo-épidémique en Afrique, Asie et Amérique. Le laboratoire des Yersinia étudie les facteurs responsables de la pathogénicité plus ou moins élevée des différentes espèces de Yersinia, les paramètres qui modulent l'expression de ces facteurs et l'organisation du génome de ces bactéries. Il a d'autre part des activités appliquées à la santé publique au niveau national (Centre National de Référence) et international (Centre Collaborateur de l'OMS). http://www.pasteur.fr/clre/

Caractérisation de l'îlot de haute pathogénicité des Yersinia

(Elisabeth Carniel)

Certaines Yersinia pathogènes hébergent des gènes de virulence regroupés en îlots de pathogénicité qui leur confèrent un haut degré de pathogénicité. Les îlots de pathogénicité sont des segments d'ADN chromosomique de grande taille, bordés le plus souvent à une extrémité par un locus tRNA et portant des gènes de virulence. Notre laboratoire étudie et compare les îlots de haute pathogénicité (HPI) des trois espèces pathogènes de Yersinia, leur degré d'instabilité, les mécanismes d'excision, les gènes portés, et leur importance dans la virulence bactérienne.

  1. Caractérisation de l'îlot de haute pathogénicité de Y. pestis

(Carmen Buchrieser)

L'analyse d'un segment d'ADN chromosomique instable de 102 kb décrit précédemment par R. Perry et dénommé "pgm locus" nous a permis de montrer qu'il était composé de deux parties distinctes: un segment de pigmentation de ‰ 68 kb et un segment de ‰ 35 kb portant les gènes impliqués dans la capture du fer et qui représente l'HPI per se de Y. pestis. Nous avons de plus démontré que différents remaniements (délétions de tailles variables, mutations ponctuelles dans les gènes de structure ou des gènes accessoires) se produisaient dans le segment de pigmentation et étaient responsables de la perte du phénotype pigmenté chez Y. pestis.

2. Caractérisation de l'HPI de Y. pseudotuberculosis (Carmen Buchrieser)

Nous avons caractérisé l'HPI et le segment de pigmentation de Y. pseudotuberculosis et montré que les deux segments étaient pratiquement identiques à ceux de Y. pestis. Cependant, alors que chez Y. pestis, ces deux segments sont adjacents sur le chromosome et délètent en bloc, chez Y. pseudotuberculosis ils peuvent être séparés par au moins 190 kb d'ADN chromosomique et seul l'HPI est instable. L'excision précise de l'HPI résulte d'une recombinaison entre deux séquences répétées de 17 pb situées aux extrémités de l'îlot. Cette recombinaison, probablement site spécifique, serait médiée par une intégrase dont le gène situé sur l'HPI, présente une forte homologie avec celui du phage P4. Chez Y. pseudotuberculosis, l'HPI peut s'insérer indifféremment dans chacune des trois copies chromosomiques du gène asn tRNA. .

3. Présence de l'HPI des Yersinia chez les E. coli pathogènes (Elisabeth Carniel)

La théorie actuellement la plus généralement acceptée est que les îlots de pathogénicité sont d'origine phagique et qu'ils se transmettent de bactérie à bactérie de manière horizontale. Lors d'un travail collaboratif avec l'équipe de J. Heesemann (Max von Pettenkofer Institut), la présence de l'HPI des Yersinia a été recherchée chez 220 souches de E. coli. Cet îlot a été trouvé chez 93% des EAEC, 80% des E. coli isolés d'hémocultures, 20% des EIEC, 5% des EPEC et ETEC, mais chez aucun des EHEC étudiés. L'îlot de haute pathogénicité existe donc non seulement chez les Yersinia mais aussi chez les E. coli pathogènes. Il n'a par contre pas été retrouvé chez les souches de salmonelles et shigelles analysées. Il semble donc qu'un même îlot de pathogénicité, provenant d'un genre bactérien inconnu, ait été acquis par une mécanisme de transfert horizontal par les Yersinia et par les E. coli pathogènes.

Caractérisation de souches atypiques de Yersinia ne fermentant pas le saccharose. (Annie Guiyoule)

Suite à l'isolement d'une souche atypique saccharose-, VP+ de Yersinia à partir des selles d'un homme hospitalisé pour diarrhées et douleurs de la fosse iliaque droite par le Dr. N. Desplaces (Hôpital de la Croix Saint Simon), nous avons entrepris la caractérisation de cette souche et d'autres isolats de notre collection qui présentaient cette même atypie. La recherche in vitro de marqueurs de pathogénicité a montré que toutes sauf une hébergeaient le plasmide de virulence et que toutes étaient pyrazinamidase- (marqueur de pathogénicité chromosomique). Leur pouvoir pathogène expérimental pour la souris était identique à celui des Y. enterocolitica. L'appartenance de ces souches atypiques à l'espèce Y. enterocolitica a définitivement été démontrée par hybridation ADN-ADN. Cette reclassification des souches atypiques dans le groupe des Y. enterocolitica pathogènes était importante en pratique car elle détermine directement l'attitude thérapeutique à adopter.

Centre National de Référence des Yersinia. (Elisabeth Carniel)

L'activité du CNR des Yersinia porte sur la caractérisation de souches, principalement d¹origine humaine. Le centre a de plus des activités de recherche appliquées à l'épidémiologie, à la thérapeutique et au diagnostic clinique. Il participe à la description de formes cliniques inhabituelles de yersinioses et à l'élaboration de nouvelles techniques de diagnostic biologique.

Centre Collaborateur de l'OMS
(Elisabeth Carniel)

L'activité du centre collaborateur OMS de Référence et de Recherche pour les Yersinia porte sur le typage des souches isolées du monde entier, la conservation de ces souches, la fourniture de matériel biologique, de protocoles, de conseils pratiques ou de références bibliographiques, la formation de stagiaires étrangers, et la formulation de recommandations. Le centre a de plus une activité d'expertise de souches atypiques et participe à des missions sur le terrain. Notre centre a été notamment sollicité cette année lors d'une épidémie d'appendicites dans un camp de réfugiés cambodgiens en Thaïlande pour laquelle la première étiologie retenue était celle d'une infection à Y. enterocolitica ou Y. pseudotuberculosis. Suite à une suspicion d'un cas importé de peste en Italie chez une patiente présentant des signes de peste bubonique au retour d'un voyage en Afrique du sud, nous avons également été contactés par l'Institut supérieur de santé de Rome pour confirmer le diagnostic de peste.

Enseignement

En plus de la participation ponctuelle à un certain nombre de cours, le laboratoire des Yersinia a encadré cette année la première moitié du cours de Microbiologie Fondamentale (Institut Pasteur) qui valide la partie théorique des DEA de Microbiologie des Universités Paris VI et Paris VII. Le thème de cette année était les mécanismes d'acquisition du fer chez les bactéries à Gram-.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

DELARUE Nadine, IP
DUVAQUIER Annie, IP

Chercheurs de l'unité

CARNIEL Elisabeth, IP, carniel2@pasteur.fr POSTIC Canièle, IP, dpostic@pasteur.fr
SAINT GIRONS Isabelle, IP, isgirons@pasteur.fr WERTS Catherine, IP, cwerts@pasteur.fr

Stagiaires de l'unité

BACH Sandrine, Thèse
BRENOT Audrey, Thèse
BUCHRIESER Carmen, Post-doc
GUINET Françoise, Post-doc
LENAERS Pierre, Stage
MARTI RAS Nuria, Thèse
MERCIER Lydie, Stage
PIERRE Fabrice, Stage
PIERRON Julie, Stage
TORREA Gabriella, Post-doc
TRINH THI Xuan Maï, Stage
TURK Nenad, Post-doc
VAN DEN HAUTE Bernard, DEA

Autre personnel de l'unité

BELLENGER Elisabeth, IP
BOURHY Pascale, IP
CHENAL Viviane, IP
FOURNIE-AMAZOUZ, IP
GUIYOULE Annie, IP
MARGARITA Danièle, CNRS
MARTIN Liliane, IP
OTTONE Catherine, IP
SERTOUR Natacha, IP
TRAM Cuong, IP

Publications de l'unité

98439362
98248221
98224297
98101463
99159454
99157723
99119968
99036747
98302737
98404532
98175133
98404550
99068025
99141003
98371124
98233725
98114344

Borrelia

Baranton G., Postic D.
Les leptospires.

        Baranton G., Perolat P.
        in : Traité de Microbiologie Clinique, A.  Eyquem, J. Alouf, L.         Montagnier, Edit. Piccin, Padova, Italie, , 1 vol. 1596, pages:697-     704, 705-712, 1998.

Diversité génomique chez Borrelia burgdorferi sensu lato, une caractéristique partagée de part et d'autre de l'Atlantique.

        Marti Ras N., Postic D., Baranton G.
        Médecine et  Maladies Infectieuses:28 (N° spécial 7e CEMI), 398-        399, 1998.

Prevalence of Borrelia burgdorferi s.l. in Ixodes ricinus ticks from Styria (Austria) and species identification by PCR-RFLP analysis.

        Stunzner D., Hubalek Z., Halouzka J., Postic D., Pierer K., Marth E.
        Zentralblatt für Bakteriologie, 288:471-478, 1998.

Vaccination antileptospirose.
Vaccin contre la borréliose de Lyme.

        Baranton G.
        in : Manuel des Vaccinations et d'Immunoprévention, A. Eyquem, J.       Alouf, A. Chippaux, Edit. Piccin, Padova, Italie, 1998, 1 vol. 359      pages, 148-151, 151-155, 1998.

Human leptospirosis in the Mekong delta, Viet Nam.

        Cao T.B. Van, Thuy T.T. Nguyen, San H. Ngo, Hien T. Tran, Baranton      G., Perolat P.
        Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene,     92:625-628, 1998.

Yersinia.

        Carniel E.
        in :Traité de Microbiologie Clinique, A. Eyquem, J. Alouf, L.   Montagnier, Edit. Piccin, Padova, Italie, 525-539, 1998.

Vaccination contre la peste.

        Carniel E., Mollaret H.H.
        in : Manuel des Vaccinations et d'Immunoprévention, A. Eyquem, J.       Alouf, A. Chippaux, Edit., Piccin, Padova, Italie, 143-148, 1998.

http://www.pasteur.fr/Bio/borrelia/Welcome.html Baranton G., Old I.

http://www.pasteur.fr/Bio/Leptospira/Leptospira.html Baranton G., Boursaux-Eude C.

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