Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Biochimie Microbienne

CNRS URA 1300


Responsable : RAPOPORT Georges (rapoport@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Les travaux poursuivis par l'Unité de Biochimie Microbienne concernent la régulation de l'expression génétique chez les bactéries Gram-positives : Bacillus (B. subtilis, B. thuringiensis) et Streptomyces. Les travaux réalisés ont porté sur le métabolisme de sources de carbone et d'azote, la transduction de signaux et du stress au cours de la phase stationnaire chez B. subtilis, la production de toxines entomopathogènes et d'autres facteurs de virulence chez B. thuringiensis et la réponse au choc thermique chez les Streptomyces.

Abstract

The major theme of the Unit is the study of the regulation of gene expression in Gram-positive bacteria : Bacillus (B. subtilis, B. thuringiensis) and Streptomyces. Research topics include metabolism of carbon and nitrogen sources, signal transduction and stress during the stationary phase in B. subtilis, expression of insecticidal protein toxins and other virulence factors in B. thuringiensis and related bacteria and the heat shock response in Streptomyces.

Texte du rapport

  1. Etude du régulon sigL de Bacillus subtilis (Michel Débarbouillé, Rozenn Gardan, Maryvonne Arnaud) Chez B. subtilis, le gène sigL code pour un facteur sigma homologue de sigma 54 des bactéries Gram-négatives. Le produit de ce gène est requis pour l'utilisation d'amino-acides comme sources d'azote (arginine, ornithine, isoleucine et valine). Nous avons identifié certains des gènes régulateurs spécifiques contrôlant positivement l'expression des opérons du régulon sigL. Les produits de ces gènes stimulent la transcription en se fixant sur des séquences appelées UAS, localisées à distance des promoteurs -12, -24. Ainsi, la protéine RocR stimule la transcription de deux opérons, rocABC et rocDEF, ainsi que celle d'un gène, rocG intervenant dans le catabolisme de l'arginine et de l'ornithine. Une autre protéine régulatrice, AhrC, est homologue au répresseur ArgR. Cette protéine régule positivement la transcription des gènes du système roc par un mécanisme qui reste à préciser. Nous avons pu montrer que la partie amino-terminale de RocR comporte un domaine répresseur interagissant très probablement avec l'inducteur interne, l'ornithine ou la citrulline. Nous avons récemment identifié un nouveau gène régulateur, bkdR, dont le produit contrôle positivement l'expression des gènes de l'opéron bkd intervenant dans l'utilisation de l'isoleucine et de la valine comme sources d'azote. L'expression de cet opéron est également contrôlée par un second régulateur global, CodY. CodY agit comme un répresseur dont l'activité est déclenchée par la présence d'amino-acides dans le milieu de culture. La partie amino-terminale de BkdR contient deux domaines de type PAS précédemment identifiés chez les mammifères, les insectes, les plantes et les champignons. Les domaines PAS sont impliqués chez ces organismes dans des interactions protéine-protéine. La partie amino-terminale de la protéine RocR contient elle aussi un domaine de type PAS. Il semble probable que ces domaines interviennent dans le contrôle de l'activité de ces régulateurs en réponse à la présence d'inducteur dans le milieu de culture.
  2. Réponse à l'environnement chez Bacillus subtilis (Tarek Msadek, Isabelle Derré) Nous avons récemment caractérisé un nouveau groupe de gènes comprenant clpC, clpP et clpE, dont l'expression répond aux conditions générales de stress, y compris le choc thermique. En effet, leur expression est contrôlée négativement par le produit du gène ctsR, premier gène de l'opéron clpC. Il a été montré que CtsR reconnaît le motif A/GGTCAAANANA/GGTCAAA. Cette séquence est présente dans le génome de B. subtilis uniquement en amont de l'opéron clpC et des gènes clpP et clpE. Le régulon CtsR est extrêmement bien conservé parmi les bactéries Gram-positives à bas GC %, dont de nombreux pathogènes (Listeria monocytogenes, Streptocoques, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile et Bacillus anthracis). Des expériences de Western blot indiquent que la protéine serait rapidement dégradée à 48° C. Par ailleurs, des résultats préliminaires suggèrent que CtsR pourrait détecter directement les températures élevées en agissant comme un " thermomètre cellulaire ", qui subirait un changement de conformation, empêchant sa fixation à l'ADN et permettant sa dégradation rapide. La séquence complète du génome de Bacillus subtilis a permis l'identification d'un nouveau gène dont le produit possède une forte similitude avec les ATPases Clp. Nous avons désigné ce gène clpE, car il constitue un nouveau type de protéines Hsp100. Le gène clpE est transcrit à partir de deux promoteurs de type sA, tous deux inductibles par le choc thermique ou un traitement à la puromycine. CtsR contrôle négativement l'expression de clpE en se fixant à la région des promoteurs, dans laquelle cinq sites de fixation pour CtsR ont été mis en évidence.
  3. Etude de la virulence de Bacillus thuringiensis (Didier Lereclus, Hervé Agaisse, Myriam Gominet, Sylvie Salamitou) Les recherches portant sur l'expression des gènes de virulence de Bacillus thuringiensis ont conduit à caractériser un activateur transcriptionnel qui contrôle l'expression d'au moins quinze gènes codant pour des protéines exportées. Il s'agit de phospholipases, de protéases, d'entérotoxines et de protéines de paroi. Cet activateur transcriptionnel, PlcR, a donc un effet pléiotrope sur l'expression de plusieurs gènes potentiellement impliqués dans la virulence. Dans tous les cas, la région promotrice de ces gènes comporte une courte séquence palindromique conservée qui est vraisemblablement la cible reconnue par PlcR. Une mutagénèse insertionnelle avec Tn10 nous a permis d'identifier différents gènes impliqués dans la régulation de plcR ; leur caractérisation est en cours. Le gène plcR a été interrompu chez B. thuringiensis de façon à évaluer son rôle dans la virulence. Les premiers résultats obtenus indiquent que la délétion de plcR abolit l'effet synergique des spores sur l'activité insecticide des cristaux. L'ensemble de ces données suggèrent donc que le régulon plcR joue un rôle majeur dans la virulence de B. thuringiensis, mais aussi de B. cereus, une bactérie apparentée où le même régulon est présent.
  4. Amélioration biotechnologique de Bacillus thuringiensis (Vincent Sanchis, Hervé Agaisse, Olivia Arantès, Didier Lereclus, Pascale Servant) Sur le plan appliqué, nos travaux ont porté sur l'amélioration des performances des biopesticides formulés à partir de B. thuringiensis (Bt). Nous avons notamment introduit le gène cry1C, qui code pour une delta-endotoxine spécifiquement active contre certains ravageurs tels que Spodoptera littoralis ou Spodoptera exigua, dans une souche de Bt qui synthétise une delta-endotoxine de type Cry1Ac très active contre Ostrinia nubilalis. La souche recombinante ainsi obtenue produit à la fois les toxines Cry1C et Cry1Ac et possède un spectre d'acitvité élargi et une meilleure toxicité contre plusieurs ravageurs importants des cultures. De plus, nous avons construit des souches recombinantes asporogènes incapables de survivre dans l'environnement. Pour cela, des gènes impliqués dans le processus de sporulation comme spo0A ou sigK ont été interrompus. Les séquences d'ADN étranger présentes ont été éliminées en faisant appel aux propriétés d'intégration et de recombinaison site-spécifique du transposon Tn4430, présent chez la plupart des souches de Bt. Nous avons également montré qu'en introduisant le gène cry1C, sous le contrôle du promoteur du gène cry3A (qui ne dépend pas de la sporulation), dans le mutant asporogène sigK de Bt, il était possible d'augmenter la quantité totale de delta-endotoxines. Les souches asporogènes ainsi construites produisent des cristaux insecticides qui restent encapsulés dans le compartiment de la cellule-mère et nous avons pu montrer que ce procédé protège les cristaux d'une dégradation par les UV. Ce dernier point permet de répondre à la principale faiblesse des biopesticides à base de Bt, à savoir leur faible persistance dans l'environnement. Par ailleurs, dans le cadre d'un programme de l'OMS, le transfert de gènes de B. thuringiensis var. israelensis et var. jegathesan a permis de construire des souches recombinantes de B. sphaericus possédant une activité plus grande vis-à-vis des larves de moustiques (Aedes, Culex), vecteurs de maladies tropicales.

5 Etude de la réponse aux stress chez les Streptomyces (Philippe Mazodier, Cosette Grandvalet, Julie Viala, Valérie de Crécy-Lagard) Les Streptomyces sont des bactéries filamenteuses sporulantes du sol qui produisent plus de la moitié des 10 000 antibiotiques connus. Nous avons entrepris une étude de la réponse adaptative aux stress, car celle-ci intervient au cours du cycle de différenciation morphologique et physiologique des Streptomyces. Nous avons montré qu'il existe de nombreuses familles de paralogues impliqués dans la réponse aux stress (2 groEL, 2 dnaJ, 4 clpP, 2 clpC, etc...) et de nombreux modes de régulation. Nous avons cloné et caractérisé trois répresseurs dont deux originaux : HspR, le répresseur de l'opéron dnaK ainsi que du gène clpB et RheA, le répresseur du gène hsp18. En particulier, nous avons montré la fixation de HspR sur son opérateur HAIR. En plus des régulations transcriptionnelles, nous avons mis en évidence des régulations post-transcriptionnelles. Cette multiplicité de gènes et de contrôles doit permettre la parfaite adaptation des Streptomyces à tous les stress créés par les variations de leur environnement, le sol. Par ailleurs, nous avons montré que le complexe protéolytique ClpP/ClpX était impliqué dans la régulation de la différenciation morphologique et physiologique des Streptomyces. En effet, un mutant clpP1 est incapable de se différencier, il a un phénotype " bald " défini par l'incapacité de former un mycélium aérien. Par ailleurs, la surexpression des gènes clpP et/ou clpX accélère la différenciation et la production de certains antibiotiques. La caractérisation de la cible de cette protéase est en cours. La connaissance du contrôle du cycle de différenciation des Streptomyces présente un intérêt certain pour l'exploitation de ces microorganismes en biotechnologie.

Mots-clés
Bacillus, Streptomyces, métabolisme carboné et azoté, transduction de signaux, stress, toxines entomopathogènes, antibiotiques.

Lien
http://www.pasteur.fr/Bio/SubtiList

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

CHAUVIN Ninon, IP
DUGAST Christine, IP

Chercheurs de l'unité

AGAISSE Hervé, CR INRA
DEBARBOUILLE Michel, DR CNRS
KLIER André, Pr Paris 7
LERECLUS Didier, DR INRA
MAZODIER Philippe, CL IP
MSADEK Tarek, CR IP
RAPOPORT Georges, DR CNRS, Pr IP
SALAMITOU Sylvie, CR CNRS
SANCHIS Vincent, CR INRA

Stagiaires de l'unité

CHASTANET Arnaud, DEA
DERRE Isabelle, Thèse
GRANDVALET Cosette, ATER Paris 7
OULD ALI Naïma, Thèse
ROBICHON Denis, Post-doc.
SERVANT Pascale, ATER Paris 7
SOBCZYK André, Post-doc.
VIALA Julie, Thèse

Autre personnel de l'unité

ARNAUD Maryvonne, Ingénieur IP
BIGNON-TOPALOVIC Joëlle, Technicienne IP GOMINET Myriam, Technicienne IP
HULLO Marie-Françoise, Ingénieur CNRS

Publications de l'unité

Publications 1998 / 1999

T. MSADEK, V. DARTOIS, F. KUNST, M-L. HERBAUD, F. DENIZOT and G. RAPOPORT : ClpP of Bacillus subtilis is required for competence development, motility, degradative enzyme synthesis, growth at high temperature and sporulation. Mol. Microbiol., 1998, 27 : 879-914. G. T. VILAS-BOAS, L. A. VILAS-BOAS, D. LERECLUS and O. M. N. ARANTES : Bacillus thuringiensis conjugation under environmental conditions. FEMS Ecology, 1998, 27 : 879-914. E. SCHNEPF, N. CRICKMORE, J. VAN RIE, D. LERECLUS, J. BAUM, J. FEITELSON, D. R. ZEIGLER and D. H. DEAN : Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1998, 62 : 775-806. J. ZHANG, H. U. SCHAIER, W. SCHNETTER, D. LERECLUS and H. AGAISSE : Bacillus popilliae cry18Aa operon is transcribed by sE and sK form of RNA polymerase from an identical initiation site. Nucl. Acids Res., 1998, 26 : 1288-1293. V. DARTOIS, M. DEBARBOUILLE, F. KUNST and G. RAPOPORT : Characterization of a novel member of the DegS-DegU regulon affected by salt stress in Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 1998, 180 : 1855-1861. I. MARTIN-VERSTRAETE, V. CHARRIER, J. STULKE, A. GALINIER, B. ERNI, G. RAPOPORT and J. DEUTSCHER : Antagonistic effects of dual PTS-catalyzed phosphorylation on the Bacillus subtilis transcriptional activator LevR. Mol. Microbiol., 1998, 28 : 293-303. U. GERTH, E. KRUGER, I. DERRE, T. MSADEK and M. HECKER : Stress induction of the Bacillus subtilis clpP gene encoding a homologue of the proteolytic component of the Clp protease and the involvement of ClpP and ClpX in stress tolerance. Mol. Microbiol., 1998. 28 : 787-802. J. STULKE, M. ARNAUD, G. RAPOPORT and I. MARTIN-VERSTRAETE : PDR - a protein domain involved in PTS-dependent induction and carbon catabolite repression of catabolic operons in bacteria. Mol. Microbiol., 1998, 28 : 865-874 (Revue). A. WILCKS, N. JAYASWAL, D. LERECLUS and L. ANDRUP : Characterization of plasmid pAW63, a second self-transmissible plasmid in Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD73. Microbiology, 1998, 144 : 1262-1270. C. GRANDVALET, G. RAPOPORT and P. MAZODIER : hrcA, encoding the repressor of the groEL genes in Streptomyces albus G, is associated with a second dnaJ gene. J. Bacteriol., 1998, 180 : 5129-5134. N. CRICKMORE,, D. R. ZEIGLER, J. FEITELSON, E. SCHNEPF, J. VAN RIE, D. LERECLUS, J. BAUM and D. H. DEAN : Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol.& Mol. Biol. Rev., 1998, 62 : 807-813. A. GALINIER, J. DEUTSCHER and I. MARTIN-VERSTRAETE : Phosphorylation of either Crh or HPr mediates binding of CcpA to the Bacillus subtilis xyn cre and catabolite repression of the xyn operon. J. Mol. Biol., 1999, 286 : 307-314. I. DERRE, G. RAPOPORT and T. MSADEK : CtsR, a novel regulator of stress and heat shock response, controls clp and molecular chaperone gene expression in Gram-positive bacteria. Mol. Microbiol., 1999, 31 : 117-131. C. GRANDVALET, V. DE CRECY-LAGARD and P. MAZODIER : The ClpB ATPase of Streptomyces albus G belongs to the HspR heat shock regulon. Mol. Microbiol., 1999, 31 : 521-532. V. DE CRECY-LAGARD, P. SERVANT-MOISSON, J. VIALA, C. GRANDVALET and P. MAZODIER : Alteration of the synthesis of the Clp ATP-dependent protease affects morphological and physiological differentiation in Streptomyces. Mol. Microbiol., 1999, 32 : 505-518. M. DEBARBOUILLE, R. GARDAN, M. ARNAUD and G. RAPOPORT : The role of BkdR, a transcriptional activator of the SigL-dependent isoleucine and valine degradation pathway in Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 1999, 181 : 2059-2066. T. MSADEK : When the going gets tough : survival strategies and environmental signaling networks in Bacillus subtilis. Trends In Microbiology, 1999, 7 : 201-207. I. DERRE, G. RAPOPORT, K. DEVINE, M. ROSE and T. MSADEK : ClpE, a novel type of HSP100 ATPase, is part of the CtsR heat shock regulon of Bacillus subtilis. Mol. Microbiol., 1999, 32 : 581-595. N. FAIRES, S. TOBISCH, S. BACHEM, I. MARTIN-VERSTRAETE, M. HECKER and J. STULKE : The catabolite control protein CcpA controls ammonium assimilation in Bacillus subtilis. J. Molec. Microbiol. Biotechnol., 1999, 1 : I. MARTIN-VERSTRAETE, J. DEUTSCHER and A. GALINIER : Phosphorylation of HPr and Crh by HprK, early steps in the catabolite repression signalling pathway for the Bacillus subtilis levanase operon. J. Bacteriol., 1999, 181 : 2966-2969.

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