Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Biologie Moleculaire Expression Genique

CNRS URA 1773


Responsable : ISRAËL Alain (aisrael@pasteur.fr)

Résumé du rapport

Les projets du laboratoire portent sur l'étude de deux systèmes de signalisation caractérisés par des événements inductibles de protéolyse, aboutissant au transport nucléaire de facteurs de transcription. Un premier projet concerne la famille de facteurs de transcription rel/NF-kappaB, dont l'activité est contrôlée par des mécanismes de rétention cytoplasmique impliquant des molécules appartenant à la famille IkappaB : divers types de signaux induisent la phosphorylation puis la dégradation de ces inhibiteurs, ce qui permet le transport nucléaire des complexes NF-kappaB. Nous étudions les diverses étapes de cette voie d'activation par des approches génétiques et biochimiques, ainsi que les différences existant entre les 3 types d'inhibiteurs. D'autre part nous avons entrepris une approche à base de transgénèse et d'inactivation génique pour comprendre le rôle de l'activité NF-kappaB in vivo, au cours du développement et dans les différents tissus. Un second projet porte sur la protéine Notch, un récepteur transmembranaire impliqué dans la spécification des destins cellulaires qui se fait lors d'interactions cellules-cellules dans divers tissus. Des résultats récents de notre laboratoire suggèrent un mécanisme par lequel le signal Notch pourrait être transmis jusqu'au noyau : cette voie impliquerait une coupure protéolytique de Notch, suivie du transport nucléaire de la région intracellulaire qui se comporterait alors comme un activateur transcriptionnel, en utilisant une molécule d'ancrage à l'ADN que nous avons caractérisée dans le laboratoire. Nous avons reproduit une partie de cette voie d'activation dans un système de cultures de cellules, et avons mis en évidence plusieurs événements de protéolyse qui semblent nécessaires à la transmission de ce signal.

Abstract

The laboratory is interested in the analysis of two signaling pathways which are characterized by inducible cytoplasmic proteolytic events that result in nuclear translocation of transcription factors. One of the projects deals with the rel/NF-kappaB proteins, normally retained in the cytoplasm by a family of inhibitors (IkappaB's) which are inducibly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway following a large number of stimuli. Using biochemical and genetic approaches, we study the successive steps of this signaling cascade, and characterize the functional differences that exist between the 3 species of IkappaB molecules. Another approach to the same problem uses the techniques of transgenesis and gene inactivation to understand the function of NF-kappaB in vivo during developement and in the different tissues. A second project concerns the study of the Notch receptor, which is responsible for specifying cell fate following cell-cell interactions. Recent results from our lab have led to a model according to which the Notch receptor is processed by an intracytoplasmic protease following ligand binding, leading to the nuclear translocation of the intracellular part of this molecule, which in turn behaves as a transcriptional activator through association with a DNA-binding protein, Su(H), which we have characterized. We have reproduced this cascade in a cell culture system, and have identified additional proteolytic events which seem to be necessary for signal transmission.

Texte du rapport

Analyse génétique des voies d'activation des facteurs de transcription NF-kappaB (G. Courtois, S. Yamaoka, C. Bessia)
Deux lignées incapables de répondre à la plupart des signaux d'activation de NF-kappaB ont été isolées et caractérisées. La complémentation de l'une d'elles à l'aide de banques d'ADNc a permis d'isoler un clone codant une protéine de 48 kD, NEMO, qui fait partie du complexe de haut poids moléculaire IKK responsable de la phosphorylation inductible des inhibiteurs IkappaB. NEMO est nécessaire à l'activation de NF-kappaB par tous les stimuli qui ont pu être testés.

Activation de NF-kappaB par la protéine X du virus HBV (R. Weil) A la suite d'un signal d'activation, l'inhibiteur IkappaBalpha est dégradé, resynthétisé rapidement et transporté dans le noyau où il dissocie les complexes NF-kappaB liés à l'ADN et les exporte vers le cytoplasme : ce mécanisme assure le caractère transitoire de l'activation de NF-kappaB. La protéine X s'est révélée capable de s'associer avec l'inhibiteur IkappaBalpha néosynthétisé et de l'accompagner dans le noyau, où elle bloque son activité inhibitrice envers NF-kappaB, permettant ainsi de prolonger l'effet d'un signal comme le TNF, une cytokine connue pour être secrétée dans le foie au cours de l'infection par HBV.

Analyse de l'activité NF-kappaB in vivo (S. Mémet, A. Lilienbaum, B. Goudeau) Cette question a été abordée par la construction de souris portant un gène lacZ sous le contrôle de sites de fixation pour NF-kappaB, permettant ainsi de visualiser les sites d'activation de NF-kappaB dans l'animal. Puis le gène codant l'inhibiteur IkappaB epsilon a été invalidé, permettant ainsi de préciser son rôle dans le système immunitaire. D'autre part une approche permettant d'exprimer de manière inductible l'inhibiteur IkappaB alpha dans un tissu donné a été entreprise. Un effort particulier a été porté sur le cerveau, organe que les souris portant le gène lacZ avaient montré comme étant un site important d'activité NF-kappaB. Dans cette optique la réponse aux signaux d'activation de NF-kappaB est étudiée dans des neurones en culture.

La voie de signalisation Notch
(C. Brou, S. Jarriault, F. Logeat, C. Strong, O. LeBail) Nous avons proposé un modèle selon lequel l'activation du récepteur Notch implique 3 étapes de protéolyse. L'enzyme responsable de la première étape a été identifiée : il s'agit de la furine, qui clive le récepteur dans sa région extracellulaire et donne naissance à deux parties qui restent associées par une liaison non-covalente. Cette coupure est nécessaire à l'expression à la membrane d'un récepteur fonctionnel. Une seconde étape de coupure nécessaire à l'activation, toujours dans la région extracellulaire, a été caractérisée. La purification de cette activité est en cours. Parallèlement, afin de permettre de tester des mutants dans un contexte physiologique, un système cellulaire constitué de cellules exprimant le récepteur Notch mises en contact avec des cellules exprimant un des ligands de Notch a été mis au point, et permet d'observer une activation transcriptionnelle de certains gènes-cibles.

Mots-clés : NF-kappaB, signaling, brain, knock-out, Notch, proteolysis, furin, metalloprotease

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

AYTAC Marie-Dominique, IP

Chercheurs de l'unité

BROU Christel, IP
COURTOIS Gilles, INSERM
ISRAËL Alain, CNRS
LILIENBAUM Alain, CNRS
LOGEAT Frédérique, CNRS
MÉMET Sylvie, INSERM

Stagiaires de l'unité

JARRIAULT Sophie, Thèse
STRONG, Clare, Post-Doc
WEIL Robert, Post-doc
WHITESIDE Simon, Post-doc
YAMAOKA Shoji, Post-Doc

Autre personnel de l'unité

BESSIA Christine, technicienne IP
GOUDEAU Bertrand, AI CNRS
HUCHET Stéphanie, IP
LE BAIL Odile, Ingénieur IP

Publications de l'unité

98319237

98318619

98232198

140QK-0052 (Current contents)

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