Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Biologie des Régulations immunitaires pour l'année 1999


Responsable : LECLERC CLAUDE (cleclerc@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L'activité de l'Unité est centrée sur la compréhension des mécanismes qui contrôlent la présentation des antigènes aux lymphocytes T, CD4+ et CD8+, l’activation de réponses T cytotoxiques et sur la mise au point de nouvelles stratégies vaccinales. Nous abordons notamment l'étude des réponses T, CD4+ et CD8+ dirigées contre des antigènes délivrés par divers vecteurs utilisant des voies de présentation endogènes ou exogènes et la caractérisation des cellules présentatrices d’antigènes impliquées dans ces réponses. L’influence de ces vecteurs sur la maturation/activation des cellules dendritiques est également analysée afin d’appréhender les divers mécanismes responsables de l’activation des réponses T, CD8+. Nous avons récemment développé plusieurs nouvelles stratégies d'activation de réponses T cytotoxiques anti-virales et anti-tumorales, basées sur la capacité de certaines molécules exogènes à pénétrer dans le cytoplasme des cellules et à y délivrer des épitopes CD8+. Un autre objectif de l'Unité est de construire des glycopeptides synthétiques portant des motifs saccharidiques afin d'induire des réponses anti-tumorales. Ceci vient d'être réalisé en utilisant le motif Tn, qui est associé aux protéines de type mucine.

Abstract

The activity of our laboratory is focused on the understanding of the mechanisms that control the presentation of antigens to T lymphocytes, the activation of cytotoxic T cell responses and on the development of new strategies of vaccination. We analyze CD4+ and CD8+ T cell responses induced against a foreign antigen delivered to the immune system by various vectors reaching the MHC molecules following exogenous or endogenous pathways. We also characterize the antigen-presenting cells which trigger these T cell responses. We have recently developed several new strategies of activation of anti-viral or anti-tumoral cytotoxic T cell responses, based on the ability of some exogenous molecules to invade cell cytosol and therefore to deliver CD8+ T cell epitopes to class I pathway. Another topic of our laboratory concerns the elaboration of a fully synthetic glycopeptide carrying saccharidic epitopes to induce anti-tumoral immune responses. This aim was recently reached for the Tn motif, which is associated to mucine proteins. Finally, one aspect of our program concerns the development of hybrid proteins, presenting conserved HIV regions, in order to induce anti-viral antibody responses with the capacity to neutralize a large spectrum of HIV isolates.

Texte du rapport

Induction de réponses T cytotoxiques antivirale et antitumorale par l'adénylcyclase de Bordetella pertussis (C. Fayolle, G. Dadaglio, Z. Moukrim)

L'adénylcyclase de Bordetella pertussis est capable de pénétrer dans le cytoplasme des cellules et possède des sites "permissifs" dans son extrémité N-terminale permettant d'insérer des peptides étrangers. Plusieurs toxines recombinantes ont été obtenues par insertion génétique dans l'extrémité N-terminale de divers épitopes viraux reconnus par les lymphocytes T CD8+ (collaboration avec A. Ullmann, D. Ladant et collaborateurs, IP). L'évaluation du pouvoir des toxines recombinantes à induire in vivo des réponses T spécifiques des épitopes insérés a été réalisée chez la souris. Des réponses T cytotoxiques et auxiliaires de type Th1 ont pu être détectées après immunisation avec ces toxines recombinantes. Un mutant de la toxine recombinante ayant subi une modification génétique au niveau du site catalytique et dépourvu d'activité enzymatique, est également capable d'induire in vivo de fortes réponses cytotoxiques. De plus, des souris immunisées par une toxine recombinante portant un épitope du virus LCMV sont protégées contre une épreuve intracérébrale par ce virus, qui normalement tue les souris non immunisées en sept jours (collaboration avec M.F. Saron, IP) (Saron et al., PNAS, 1997, 94: 3314). Afin de mettre au point des stratégies propres à permettre le développement de vaccins "anti-cancer", nous avons utilisé un modèle de tumeur induite chez la souris par des cellules tumorales exprimant le gène de l’ovalbumine (OVA). Des toxines recombinantes portant un épitope CD8+ de l’ovalbumine sont capables d’induire des réponses CTL spécifiques de type CD8+. En outre, des injections prophylactiques ou thérapeutiques de ces toxines augmentent très significativement la survie de souris recevant la greffe de cellules tumorales exprimant l’épitope OVA. L'ensemble de ces données indiquent donc qu'il est possible d'induire des réponses cytotoxiques antitumorales protectrices après immunisation avec des adénylcyclases recombinantes portant des épitopes CTL (Fayolle et al, J.Immunol., 1999, 162:4157).

De larges régions protéiques ont pu être insérées dans la toxine tout en gardant ses propriétés invasives et sa capacité à induire des réponses T cytotoxiques. Ainsi, des toxines dans lesquelles ont été insérées de larges régions antigéniques contenant le même épitope T CD4+ et CD8+ répété plusieurs fois (collaboration avec Peter Sebo, Prague) sont capables d’induire des réponses T cytotoxiques CD8+ et auxiliaires CD4+ spécifiques de ces épitopes. L’insertion de plusieurs copies de ce même épitope augmente fortement les réponses T CD4+ et à un moindre degré les réponses T CD8+. L’insertion de larges fragments peptidiques n’affecte pas l’induction de réponses T par l’adénylcyclase, ce qui permet d’envisager la mise au point de stratégies vaccinales permettant de stimuler des réponses T cytotoxiques polyspécifiques. Des toxines recombinantes portant les épitopes CTL de l’ovalbumine, du virus LCMV et de la boucle V3 du VIH ont été construites permettant la délivrance simultanée de ces épitopes aux cellules présentatrices de l’antigène. L’injection de ces toxines conduit à l’induction de réponses T cytotoxiques dirigées contre ces trois épitopes. De plus, nous avons montré que les souris immunisées par ces molécules sont protégées contre une épreuve intracérébrale létale par le virus LCMV.

Différents épitopes tumoraux provenant de mélanomes ou de carcinomes humains et restreints par la molécule de classe I humaine HLA-A2 ont été insérés dans la toxine CyaA. Ces toxines ont été testées chez des souris HHD transgéniques pour la molécule HLA-A2 (collaboration avec F. Lemonnier, Institut Pasteur). Certaines de ces toxines induisent de fortes réponses CTL spécifiques montrant que l’adénylcyclase est capable d’induire des réponses cytotoxiques dirigées contre des antigènes tumoraux naturels humains. Des toxines recombinantes portant des polyépitopes exprimés par des cellules de mélanome humain sont en cours de construction et seront utilisées pour induire des réponses T cytotoxiques HLA-A2 restreintes chez les souris HHD. La reconnaissance de cellules tumorales humaines par ces CTL sera alors étudiée.

Il est couramment admis que l’initiation des réponses immunitaires en général, et des réponses T CD8+ en particulier, met en œuvre la présentation de l’antigène par les cellules dendritiques. Nous avons montré que l'adénylcyclase permet d’induire des réponses CTL très efficaces après immunisation intraveineuse, en absence d’adjuvant. Afin de mieux comprendre ce phénomène, nous avons mené une analyse des types cellulaires impliqués in vivo dans la formation des complexes CMH I-peptide présentés aux lymphocytes T CD8+. Nous avons observé que les cellules dendritiques de type myéloïde (CD11c+CD11b+CD8alpha-) semblent jouer un rôle important, sinon majeur, dans la présentation de l'adénylcyclase in vivo. L’absence d’intervention des lymphocytes B a été confirmée par l’induction efficace de réponses CTL chez des animaux génétiquement dépourvus de cellules B. Nous souhaitons désormais mieux comprendre les mécanismes sous-tendant ce ciblage fonctionnel. Nous recherchons actuellement, en collaboration avec Nadia Khelef et Daniel Ladant (IP) un éventuel récepteur cellulaire pour l'adénylcyclase. Par ailleurs, la différentiation terminale ou maturation des cellules dendritiques est désormais considérée comme un pré requis pour l’activation des cellules T CD8+. Ce processus peut être déclenché par des produits bactériens présents dans certains adjuvants ou par les cellules T CD4+, notamment via l’engagement de CD40 (sur les cellules dendritiques) par CD40L (sur les T CD4+). Nous avons observé, en immunisant des animaux génétiquement déficients en CD4 ou CD40, que l’induction de réponses T CD8+ par l'adénylcyclase ne dépend pas de la présence des T CD4+ ni de CD40. Cette observation réalisée en absence d’adjuvant suggère l’existence d’une voie alterne de différentiation terminale des cellules dendritiques induite par l'adénylcyclase elle même. Cette hypothèse fait actuellement l’objet d’une collaboration avec le laboratoire de Paola Ricciardi-Castagnoli (Université Bicocca, Milan).

Induction de réponses T cytotoxiques par des pseudo-particules virales recombinantes. (C. Li, G. Moron, G. Dadaglio)

Des pseudo-particules virales ont été produites par l'auto-assemblage de la protéine VP2 d'un parvovirus exprimant un épitope du virus LCMV (collaboration avec I. Casal, Ingenasa, Madrid). Ces pseudo-particules se sont avérées être très immunogènes. Des réponses T CD4+ et T cytotoxiques, CD8+ extrêmement élevées ont été obtenues après une seule injection de quelques microgrammes de ces pseudo-particules aux souris, et ceci en absence de tout adjuvant. Après plus de neuf mois, ces réponses sont toujours très élevées chez les animaux ainsi immunisés. Les souris immunisées avec les pseudo-particules virales exprimant l'épitope CD8+ du virus LCMV sont protégées contre une infection intracérébrale par ce même virus (Sedlik et al, PNAS, 1997, 94: 7503). Cette activité protectrice est corrélée à la présence d’une forte fréquence de CTL spécifiques de forte avidité pour l’antigène. Les mécanismes responsables de la forte immunogénicité de ces pseudo-particules sont en cours d’étude. Enfin, comme pour l’adénylcyclase, l’induction de réponses T cytotoxiques dirigées contre des épitopes tumoraux humains restreints par la molécule de classe I humaine HLA-A2, est actuellement étudiée chez les souris transgéniques pour la molécule HLA-A2.

Etude des mécanismes de délivrance de pseudo-particules virales exogènes dans la voie des molécules du CMH I (G. Moron)

Les mécanismes responsables de l’activation de réponses T cytotoxiques par des pseudo-particules virales produites par l'auto-assemblage de la protéine VP2 d'un parvovirus ont été abordées in vitro et ex vivo. Dans un premier temps, ces études ont permis d’établir le rôle majeur joué par les cellules dendritiques dans la présentation restreinte par les molécules du CMH I de ces pseudo-particules exogènes à des hybridomes T, CD8+. De plus, l’analyse de la présentation de ces pseudo-particules en présence de divers inhibiteurs ainsi que des études de microscopie confocale ont permis de préciser les mécanismes impliqués dans leur apprêtement. Les premiers résultats obtenus ont permis d’établir que la présentation de ces pseudo-particules exogènes par les molécules du CMH I ne suit pas totalement la voie des antigènes endogènes.

Analyse des réponses T cytotoxiques induites par immunisation avec des cellules dendritiques pulsées par divers vecteurs. (G. Schlecht, G. Dadaglio, M.L Aknin)

Des données récentes permettent de supposer que l’efficacité d’un vaccin est extrêmement dépendante de sa capacité à cibler les cellules dendritiques. En effet, il est bien établi que les cellules dendritiques sont capables de stimuler efficacement des cellules T naïves. Des immunisations à l’aide des sous-populations CD8alpha+ et CD8alpha- de cellules dendritiques préincubées avec les différents vecteurs élaborés dans le laboratoire sont en cours afin de comparer les réponses CTL obtenues. La comparaison se fera d’une part sur l’amplitude des réponses et d’autre part sur la persistance de ces réponses afin de déterminer s’il existe un avantage à utiliser une telle approche.

Elaboration d'un composé synthétique portant un motif saccharidique d'origine tumorale à des fins thérapeutiques et vaccinales (R. Lo-Man, Edith Dériaud)

Parmi les marqueurs saccharidiques associés aux cellules tumorales, on retrouve le motif Tn (alpha-N-acetyl-galactosamine) associé aux protéines de type mucine. Nous avons entrepris, en collaboration avec S. Bay et S. Vichier-Guerre (IP), l'élaboration d'un immunogène synthétique utilisant la structure d'un MAP (multiple antigenic peptide) contenant ce motif Tn sous forme de monomère dans le but d'induire des réponses immunitaires anti-tumorales contre ce motif Tn à des fins thérapeutiques et vaccinales. L'injection de ce composé MAG:Tn (multiple antigenic glycopeptide) à des souris conduit notamment à la production d'anticorps dirigés contre le motif Tn, capables de reconnaître le motif Tn à la surface de différentes cellules tumorales humaines et murines. Nous avons par la suite développé le MAG en incorporant un trimère Tn qui s’est révélé beaucoup plus immunogène que le composé initial. En effet, une vaccination prophylactique réalisée avec ce composé MAG:Tn3 permet de protéger les souris contre la greffe d’un adénocarcinome mammaire exprimant l’antigène Tn. De plus, lorsqu’un traitement thérapeutique est réalisé avec ce composé sur des souris porteuses d’une tumeur préétablie, il permet d’accroître très fortement la survie de ces souris. Sur la base de ces résultats nous développons actuellement des composés utilisables chez l’homme. (Lo-Man et al., Cancer Research. 1999, 59: 1520; Vichier-Guerre et coll., J. Pep. Res. 2000, 55: 173).

Etude de la réponse cellulaire T CD4+ dirigée contre un antigène délivré par des bactéries intracellulaires recombinantes et caractérisation des cellules présentatrices d’antigène impliquées. (X. Jiao et R. Lo-Man)

L’ensemble de ce travail a pour objectif d’analyser le phénotype des partenaires, lymphocytes T et cellules présentatrices d’antigènes, impliqués dans la réponse immunitaire dirigée contre des antigènes délivrés par des bactéries intracellulaires. Utilisant des souches bactériennes atténuées (S. typhimurium atténuées et BCG) exprimant un antigène modèle, la protéine MalE, une analyse longitudinale de la réponse T CD4+ anti-MalE a été réalisée. Cette analyse a permis de montrer que la spécificité peptidique de la réponse T est modulée en fonction du vecteur utilisé pour délivrer l’antigène au système immunitaire. De même, le profil cytokinique de la réponse T CD4+ subit également des variations au cours de l’infection. Par ailleurs, après administration de rBCG, nous explorons la contribution des différentes cellules présentatrices d’antigène infectées, cellules dendritiques et macrophages, dans la stimulation de la réponse T. (Ce travail est effectué en collaboration avec les équipes de M. Hofnung et de B. Gicquel, IP).

Mise au point de stratégies vaccinales permettant l’induction d’anticorps capables de neutraliser le plus large spectre possible d’isolats viraux de VIH-1 (E. Coëffier-Vicart)

Un des problèmes majeurs auquel se heurte l'obtention d'anticorps protecteurs contre le virus VIH est le fort degré de variabilité du virus. Nous avons précédemment étudié la spécificité fine des anticorps induits dans différents essais vaccinaux chez l’homme afin de définir la région de la boucle V3 qui est reconnue et d'établir une corrélation entre la spécificité des anticorps et leur activité neutralisante (Coëffier et al., AIDS Res. Human Retrov, 1997, 13: 1471). Chez le chimpanzé, le protocole d’immunisation incluant la rgp160 ou le canarypox recombinant exprimant les protéines d'enveloppe puis un rappel avec le peptide V3, en induisant la production d'anticorps reconnaissant plusieurs épitopes sur la boucle V3, permet d'obtenir une protection homologue, mais n'est pas suffisant pour induire une protection vis-à-vis d'un virus hétérologue de type E (E. Coëffier et al., AIDS Res. Human Retrov, 1998, 14: 1023). Nous avons ensuite poursuivi des travaux en collaboration avec l’équipe de M. Hofnung (IP) sur l’étude de l’immunogénicité de protéines MalE hybrides dans lesquelles les séquences peptidiques correspondant à deux épitopes B de VIH-1 (l'épitope GPGRAF de la boucle V3 et l'épitope ELDKWA de l'extrémité N-terminale de la gp41), présentant un fort degré de conservation entre les isolats viraux, ont été insérées au niveau de sites permissifs dans la protéine MalE de E. coli. Ces protéines induisent chez la souris des réponses anticorps élevées contre les épitopes B insérés. Notamment dans le cas de l’épitope ELDKWAS, il est clair que sa localisation dans MalE, ses régions flanquantes et la répétition de la séquence insérée ont une influence majeure sur son immunogénicité. Ceci est en relation avec la capacité de l’anticorps monoclonal 2F5 spécifique de l’épitope étudié à reconnaître de façon préférentielle certaines de ces protéines hybrides. Par contre, avec ces protéines, de faibles réponses anticorps contre les épitopes B insérés ont été obtenues chez le lapin, le cobaye et le singe vert. De plus, aucune neutralisation n’a été observée avec les sérums des animaux ainsi immunisés.

Mots clefs: cellules dendritiques, réponses T cytotoxiques, vaccin, cancer, présentation de l’antigène.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

PIRES Servanne, IP

Chercheurs de l'unité

COËFFIER-VICART Éliane, IP, coeffier@pasteur.fr DADAGLIO Gilles, IP, gdadag@pasteur.fr
LECLERC Claude, IP, cleclerc@pasteur.fr LO-MAN Richard, IP, rloman@pasteur.fr

Stagiaires de l'unité

AKNIN Marie-Laure, Maîtrise
GUERMONPREZ Pierre, doctorant
JIAO Xinan, post-doc
LI Cuiling, post-doc
MORON Gabriel, post-doc
MOUKRIM Zohra, post-doc
SCHLECHT Géraldine, DEA

Autre personnel de l'unité

DERIAUD Edith, CNRS
FAYOLLE Catherine, IP
PIRES Servanne, IP
ROJAS Marie, IP

Publications de l'unité

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